二代＋三代＋光學的文章又雙叒發表啦

近日NG剛發了一篇高組裝質量的蘋果基因組，小編充分發揚新聞的時效性，立馬解讀給各位親～

材料：二倍體金冠蘋果

測序：120× 二代pair-end數據，80×二代mate-pair數據，35× PacBio數據，600× BioNano光學圖譜。

牛氣的地兒：

組裝質量高；在異染色質區發現了一段高重複的反轉錄轉座子序列；發現轉座子元件（TEs）在2100萬前發生大爆發，而此時正是天山山脈出現的時候（普遍認為天山山脈是蘋果的發源地），說明TEs的存在及其活動可能促進了蘋果的多樣性進化及其與梨的分化。另外，作者推測全基因組的DNA甲基化可能與蘋果果實的發育相關。

接下來，詳解。

組裝

利用120×二代pair-end數據組裝成contigs，然後利用35×三代長reads提升contigs長度，使得contigN50達到620 kb，組裝基因組達到625.2 Mb。接著利用BESST軟體搭建scaffolds。最後，利用600×光學圖譜組裝得到約649.7 Mb的基因組，而評估的基因組大小為651 Mb，兩者十分接近，說明組裝完整性好（圖1）。

接著，利用遺傳圖譜上的SNP標記來評估scaffold的組裝效果。作者在組裝基因組上檢測到14,732個SNP位點（遺傳圖譜上一共是15,417個SNP），其中又有14,117個SNP位置準確（約95.8%）。另外，通過繪製遺傳距離-物理距離曲線，發現遺傳距離和物理距離之間的差異很小（圖2）。CEGMA評估發現在248個核心基因中，蘋果基因組中存在237個，再次說明組裝完整性好。

注釋

作者共檢測到42,140個蛋白編碼基因。利用BUSCO法比較GDDH和其他蘋果基因組的注釋情況發現，雖然GDDH的編碼基因是最少的，但注釋是最完整的（表1）。

接著，作者利用SynMap分析全基因組複製，並通過circos圖展示（圖3）。發現只有少部分區域沒有共線性。

重複序列注釋發現，在GDDH13基因組中，TE元件占基因組的57.3%。其中反轉錄轉座子最多，占基因組的42.9%，而DNA轉座子僅占基因組的13.4%（圖4a）。利用REPET對PacBio+二代混合組裝得到的contig進行高度重複的TE序列（HODOR）檢測，發現在HODOR的高密度區域，重組率下降，同時其他TE元件的密度呈不變或下降趨勢（圖4b）。

繪製一致性重複序列與其拷貝的序列相似性分布圖，發現在相似性為77%時拷貝數最多，作者由此推測出在2100萬年前出現了轉座事件的大爆發（圖4c）。

甲基化

對蘋果的葉子分析發現，在CG、CHG、CHH三種模式序列中的甲基化水平分別佔49%、49%、12%（圖5a）。另外，甲基化在染色體上的分布並不均勻，並且其峰值與重組率最低點相近，也就是說甲基化水平越高，重組率越低（圖5b）。從總體上看，DNA甲基化水平在基因區有所降低，但在TE區顯著上升（圖5c）。作者進一步將基因的甲基化分為三類：第一類是該基因本身的CG和CHG模式序列及其附近區域都被高度甲基化；第二類是該基因的CG、CHG、CHH模式序列含量都很低，但基因自身被甲基化，其附近區域的甲基化水平也有所上升；第三類是基因本身及其附近區域的甲基化水平都很低。其中，以第三類甲基化形式存在的基因最多，佔64.5%。另外，作者還發現DNA甲基化水平越高，基因表達量越低。

甲基化和果實發育

作者將葉子和果實的DNA甲基化水平進行了對比，利用隱馬爾科夫模型共檢測到差異甲基化區域（DMRs）1,017個，其中CHH模式序列中含量最高（86%）。作者發現在含有DMR區域的294個基因中，14個在葉子的CHG模式序列中出現甲基化水平升高的情況，而其餘280個則在果實的CHH模式序列中出現甲基化水平升高的情況。因此作者推測葉子和果實的甲基化水平的不同主要發生在CHH模式序列中。

作者將GDDH13和與其相同親本的GDDH18進行比較，在27個雜和SNP中，有9個導致了氨基酸突變。作者推測這可能是導致GDDH18實質細胞層減少，並且果實相對更小的原因（圖6c，6d）。換言之，DNA甲基化可能會影響到果實大小。

為了闡明果實大小的差異擁有表觀遺傳學基礎，作者又分別將授粉前三天（-3DAP，果實大小相似，且實質細胞層數目相近）和授粉後9天（9DAP，果實大小發生明顯變化之前）的樣本進行出分析。發現在-3DAP的GDDH13和GDDH18樣本中，檢測到的DMR區域只有47個；而在9DAP的樣本中卻高達148個。GDDH18中含有DMR區域的基因，在這兩個時間點都出現了顯著的甲基化水平下調。

參考文獻：

Nicolas Daccord, Jean-Marc Celton, Gareth Linsmith, et al. High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit developmentNature Genetics, 2017.

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