單鹼基替換重塑超級幹細胞：訪生物物理所博士研究生楊濟平

來源：梅斯醫學

幹細胞移植治療可以通過替換病變、衰老的成體細胞，達到恢復組織器官穩態和功能的目的。這一技術在再生醫學領域具有巨大的潛力，然而由於有效性和安全性兩大問題，該技術的廣泛應用仍然受到限制。近年來，科學家們從改善移植物活力、調控移植微環境以及製備輔助支架材料等方面進行著種種嘗試，試圖突破這兩大再生醫學領域亟待解決的難題。

7月7日，Cell Research雜誌在線發表了中科院生物物理所劉光慧課題組、北京大學湯富酬課題組和中科院動物所曲靜課題組合作的題為「Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding」的研究成果（詳見：Cell Res：重大突破！劉光慧等通過單鹼基基因編輯重塑超級幹細胞）。該研究利用基因編輯技術改寫了人類基因組遺傳密碼中NRF2編碼基因第2號外顯子上的單個鹼基，首次在實驗室中獲得了遺傳增強的「超級」幹細胞（Genetically Enhanced Stem cells，GES細胞）。這種GES細胞具有對細胞衰老和致瘤性轉化的雙重抵抗作用，因此為開展安全有效的幹細胞治療提供了可能的解決方案。

該研究在劉光慧研究員、湯富酬研究員和曲靜研究員的共同指導下，主要由生物物理所博士研究生楊濟平和北京大學博士研究生李靜宜合作完成。為此梅斯醫學專訪了研究的第一作者楊濟平，請他就該研究中的一些熱點問題進行了解答。

（1）利用基因編輯產生GES的研究在國際上的研究進展如何？

楊濟平：目前，國際上尚無在人類幹細胞中進行遺傳增強操作以提高其細胞活力和抑瘤能力的報道。但在許多研究中基因編輯已經展現出巨大的潛力。例如，中科院遺傳與發育生物學研究所和中科院微生物研究所的研究人員利用基因編輯技術靶向突變了抗白粉病相關基因，獲得了改良的抗病小麥。美國學者利用CRISPR/Cas9技術靶向敲除了多酚氧化酶，獲得了不易褐變的蘑菇。在人的造血幹細胞中敲除趨化因子受體CCR5基因可以抵抗HIV病毒的感染，世界首例艾滋病的功能性治癒也已見諸報端。

（2）是如何想到利用基因編輯技術產生「遺傳增強」這一策略的？

楊濟平：我們實驗室自2011年以來一直從事著利用基因編輯進行靶向基因矯正(gene correction)的研究，目前成功矯正的遺傳疾病包括兒童早衰症、鐮刀型細胞貧血症、范可尼貧血症、帕金森氏病及脊髓側索硬化症等。此外，我們實驗室也利用靶向敲入（knock-in）技術創建了帕金森氏病和范可尼貧血症等人類疾病的幹細胞研究體系。我們也利用基因敲除技術研究了WRN，PTEN和SIRT6等蛋白的loss of function對人類幹細胞的影響。

自基因編輯工具問世以來，人們曾有過遺傳增強的幻想，包括學術界一直反對的「在生殖細胞或早期胚胎中進行基因編輯設計完美嬰兒」，但這在倫理上是受到禁止的。我們實驗室在2012年提出在體外培養的人類幹細胞中通過基因編輯技術進行遺傳增強的假設，最初的構思就是通過基因編輯技術抵抗應激和衰老以及抵抗癌變兩個方面，目標是獲得更安全有效的幹細胞移植物。

（3）這個項目做了多久？

楊濟平：自我進實驗室起，實驗室就已開展這個課題，目前已經進行了5年。

（4）為何選擇NRF2這一靶標，利用其產生GES細胞的原理是什麼？

楊濟平：NRF2是進化保守的具有細胞保護功能的轉錄因子，調控著一系列細胞保護基因的表達。在低等生物如線蟲果蠅中，NRF2同源蛋白的缺失會導致個體壽命的縮短，而NRF2同源蛋白的過表達則有延壽的效果。2016年我們實驗室發表在Cell上的論文顯示，兒童早衰病人的成纖維細胞和間充質幹細胞中NRF2的功能抑制是導致細胞加速衰老的重要原因，而激活NRF2可以顯著的緩解早衰表型。另一方面，NRF2在抑制正常細胞發生惡性轉化方面發揮著關鍵作用。比如，許多預防癌症的藥物（包括植物化合物）的作用都是通過激活NRF2實現的。已有研究表明，NRF2的缺失會使致癌物誘導的腫瘤更易發生。以上這些均提示激活NRF2可能是同時實現細胞抵抗壓力和衰老以及細胞惡性轉化的有效方案。我們激活內源NRF2的策略是在NRF2基因組的編碼區替換了一個核苷酸（A245G），使得NRF2蛋白的第82號氨基酸由谷氨酸變換為甘氨酸。這單氨基酸改變削弱了NRF2與其抑制蛋白KEAP1的相互作用，導致NRF2蛋白的穩定性提高，更多的NRF2得以進入細胞核中並加強下游細胞保護基因的轉錄。

（5）編輯NRF2基因是否會對所有人類細胞類型產生遺傳增強的效應？

楊濟平：我們利用的遺傳增強策略的原理之一是通過激活內源NRF2提高細胞的抗氧化能力，從而提高細胞對氧化損傷的抵抗並延緩細胞衰老。我們已經證明了這種遺傳增強策略對中胚層細胞（如間充質幹細胞和血管內皮細胞）是有效的。其他的細胞類型還未檢測。我們認為這種策略不會對所有人類細胞類型都有增強效應。舉個例子，有報道稱神經幹細胞的增殖是依賴於活性氧（ROS）的，因此NRF2的基因編輯可能不會在這種細胞類型中有效。因此，針對不同細胞類型的遺傳增強，可能需要量體裁衣地制定「個性化」的基因編輯策略。

（6）GES細胞在治療中的安全性如何？能解釋一下嗎？

楊濟平：在此研究中，我們針對遺傳增強策略的安全性進行了細緻的評價。首先，儘管GES細胞具有更強的自我更新能力和體外傳代壽命，但是在移植入免疫缺陷小鼠體內後並不會形成腫瘤。接下來，我們也考察了引入強致癌因子後GES細胞的成瘤能力，結果發現雖然野生型細胞可以被有效地轉化成腫瘤，但GES細胞缺對癌基因誘導的「細胞癌變過程」保持著高度抵抗（包括保持著基因組的強穩定性），移植入免疫缺陷小鼠體內後不會形成腫瘤。這說明GES細胞的腫瘤易感性非但沒有提高，反而非常抵抗惡性轉化。另一方面，經過遺傳增強的人類胚胎幹細胞在免疫缺陷小鼠體內僅能產生比對照胚胎幹細胞小得多的畸胎瘤。該結果提示了即便GES細胞移植物中混雜了少量未分化的多能幹細胞，其在體內形成畸胎瘤的能力也會被大大削弱，這就進一步降低了利用遺傳增強型多能幹細胞進行細胞移植治療的安全風險。

（7）該工作在認識細胞衰老和細胞致瘤性轉化的分子機制方面有何意義？

楊濟平：過去人們對NRF2的研究大多數是基於人類腫瘤細胞系，由此得出的實驗結果多認為NRF2會促進腫瘤細胞的增殖和存活。而我們的工作是在正常非腫瘤細胞中通過基因敲入（增強內源NRF2功能）的研究證明了NRF2具有阻止正常細胞發生「癌變」的作用。這兩者並不矛盾，因為已經癌變的細胞非常「聰明」，可能會利用NRF2的細胞保護機制實現自身的惡性；而我們證明的NRF2的抗癌防癌作用則表現為維持正常體細胞的基因組穩定，減少突變的發生，進而遏制細胞的惡性轉化。我們基於基因編輯的研究為NRF2保護正常細胞的惡性轉化提供了直接的證據。在此之前，人們並不明確內源性NRF2在非腫瘤的正常人類細胞中究竟發揮著抑癌或促癌的作用。另一方面，我們的研究也提供了NRF2激活抑制人類間充質幹細胞衰老的直接證據。

（8）為何選擇HDAdV基因編輯技術，而不是CRISPR/Cas9?

楊濟平：我們最初起始該課題的研究時，CRISPR/Cas9技術才剛剛問世，尚沒有得到在人類細胞中的應用。而同期我們課題組已經成功的利用HDAdV技術矯正或敲入了若干種人類致病基因突變。此外，由於HDAdV技術完全利用大片段DNA同源重組進行基因編輯，具有很低的安全隱患。並且我們在接下來的研究中也證明了HDAdV基因編輯技術的高度安全性（Cell Stem Cell 2014）。因此HDAdV技術是我們最好的選擇。後來CRISPR/Cas9技術問世後，我們也嘗試過利用該方法靶向編輯基因組。然而，由於我們需要改造NRF2基因上的單一核苷酸，因此在選擇gRNA序列時希望儘可能的靠近該核苷酸。然而在此核苷酸附近可選擇設計的gRNA序列有限，我們嘗試了最靠近的3個gRNA序列，但是它們在人類胚胎幹細胞中的基因組切割效率較低，不易實現同源重組。從技術層面上講，並不是任何一個核苷酸的置換都可以用CRISPR/Cas9完成的。

（9）GES細胞在臨床上可能具有哪些應用前景？

楊濟平：從我們初步的動物體內移植實驗結果看，NRF2編輯的間充質幹細胞對血管系統的修復具有顯著的作用。因此，我們認為基於NRF2基因編輯的GES細胞對與衰老相關的血管退行性病變可能具有較好的應用潛力。相關的疾病可能包括血管動脈粥樣硬化、糖尿病足以及老年眼底血管病變等。具體的應用和效果需進行更多的臨床前實驗才能得出結論。

（10）GES細胞未來在技術和應用方面還可能進行哪些改進？

楊濟平：我認為可能是遺傳增強方案的個性化改進，針對不同的組織器官類型及疾病特性可以設計不同的遺傳增強方案。包括對不同基因和不同信號通路的精細調控，對不同體細胞類型的定向改造等。我們也正在設計基於誘導多能幹細胞（iPSC）的遺傳增強策略。此外，GES細胞配合特殊的生物材料載體也可能會產生更佳的治療效果。

（11）是否已經考慮將這種技術推向臨床？

楊濟平：目前這項研究成果已經申請了國內和國際專利，我們已同國外和國內生物技術企業開展了合作，最終目標是將這項技術推向臨床。

論文共同第一作者楊濟平

論文共同第一作者李靜宜

李靜宜（左）和楊濟平（右）

楊濟平個人簡歷

學習經歷：

2008-2012 中國農業大學 本科

2012至今 中國科學院生物物理所 碩博研究生

發表論文：

1.Yang J*, Li J*, Suzuki K*, Liu X, Wu J, Zhang W, Ren R, Zhang W, Chan P, Belmonte JC, Qu J, Tang F, Liu GH. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recording. Cell Research 2017.doi:10.1038/cr.2017 (*equal contribution)

2. Wang L, Yi F, Fu L,Yang J, Wang S, Wang Z, Suzuki K, Sun L, Xu X, Yu Y, Qiao J, Belmonte JC, Yang Z, Yuan Y, Qu J, Liu GH, CRISPR/Cas9-mediated targeted gene correction in amyotrophic lateral sclerosis patient iPSCs. Protein & cell 8, 365-378 (2017)

3. Pan H, Guan D, Liu X, Li J, Wang L, Wu J, Zhou J, Zhang W, Ren R, Zhang W, Li Y,Yang J,Hao Y, Yuan T, Yuan G, Wang H, Ju Z, Mao Z, Li J, Qu J, Tang F, Liu GH, SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2. Cell research 26, 190-205 (2016)

4. Kubben N, Zhang W, Wang L, Voss TC,Yang J, Qu J, Liu GH, Misteli T, Repression of the Antioxidant NRF2 Pathway in Premature Aging. Cell 165, 1361-1374 (2016)

5. Fu L, Xu X, Ren R, Wu J, Zhang W,Yang J, Ren X, Wang S, Zhao Y, Sun L, Yu Y, Wang Z, Yang Z, Yuan Y, Qiao J, Belmonte JC, Qu J, Liu GH, Modeling xeroderma pigmentosum associated neurological pathologies with patients-derived iPSCs. Protein & cell 7, 210-221 (2016)

6. Duan S, Yuan G, Liu X, Ren R, Li J, Zhang W, Wu J, Xu X, Fu L, Li Y,Yang J, Zhang W, Bai R, Yi F, Suzuki K, Gao H, Esteban CR, Zhang C, Belmonte JC, Chen Z, Wang X, Jiang T, Qu J, Tang F, Liu GH, PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature communications 6, 10068 (2015)

7. Zhang W, Li J, Suzuki K, Qu J, Wang P, Zhou J, Liu X, Ren R, Xu X, Ocampo A, Yuan T,Yang J, Li Y, Shi L, Guan D, Pan H, Duan S, Ding Z, Li M, Yi F, Bai R, Wang Y, Chen C, Yang F, Li X, Wang Z, Aizawa E, Goebl A, Soligalla RD, Reddy P, Esteban CR, Tang F, Liu GH, Belmonte JC, Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science 348, 1160-1163 (2015)

8.Yang J*, Cai N*, Yi F*, Liu GH, Qu J, Belmonte JC, Gating pluripotency via nuclear pores. Trends in molecular medicine 20, 1-7 (2014) (*equal contribution)

9. Xu X,Yang JP, Fu LN, Ren RT, Yi F, Suzuki K, Liu K, Ding ZC, Qu J, Zhang WQ, Li Y, Yuan TT, Yuan GH, Sui LN, Guan D, Duan SL, Pan HZ, Wang P, Zhu XP, Montserrat N, Li M, Bai RJ, Liu L, Belmonte JC, Liu GH, Direct reprogramming of porcine fibroblasts to neural progenitor cells. Protein & cell 5, 4-7 (2014)

10. Gu Y, Liu GH, Plongthongkum N, Benner C, Yi F, Qu J, Suzuki K,Yang J, Zhang W, Li M, Montserrat N, Crespo I, Del Sol A, Esteban CR, Zhang K, Belmonte JC, Global DNA methylation and transcriptional analyses of human ESC-derived cardiomyocytes. Protein & cell 5, 59-68 (2014)

11. Wang P, Zhang W,Yang J, Qu J, Liu GH, Higher-order genomic organization in pluripotent stem cells. Protein & cell 3, 483-486 (2012)

楊濟平博士生導師劉光慧簡介

劉光慧，研究員，中國科學院大學崗位教授。國家傑出青年科學基金獲得者，幹細胞國家重大科學研究計劃（973）項目首席科學家。現任中國老年醫學學會基礎與轉化醫學分會副會長，中國老年醫學研究機構聯盟副主任委員，中國老年學和老年醫學學會抗衰老分會副主任委員，中國細胞生物學學會幹細胞生物學分會委員，中國生物物理學會理事，Protein &Cell雜誌副主編。近年來在基因編輯、幹細胞和衰老領域取得了系列原創性研究成果。回國後以通訊或共同通訊作者身份在Nature，Science，Cell，Cell Stem Cell, Cell Res和Nature Commun等雜誌發表系列研究論文。授權或申請發明專利（第一發明人）14項。獲首屆老年醫學傑出貢獻獎。

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