強！中國造豬瘟疫苗世界領先，被BVDV污染的最大弱點也能克服了！

BVDV與豬瘟同屬黃病毒科瘟病毒屬，根據豬體免疫攻毒試驗、瓊脂擴散試驗、中和試驗和免疫熒光試驗，已經充分證明BVDV和豬瘟病毒之間存在免疫學關係，這兩種病毒可能含有共同的可溶性抗原。

為什麼豬瘟疫苗中BVDV難控制

《農財寶典》新牧網 王之嫻

豬瘟疫苗的生產工藝，經過多年的長足發展，已經從早期的脾淋苗、組織苗進步到現在的細胞苗、傳代細胞苗。細胞苗相對於脾淋苗來說，節省了兔子的使用量，降低了生產成本、擴大了生產效率，同時也提高了抗原含量、提高了穩定性。業內專家普遍認為細胞苗技術相對於舊的脾淋苗是一項技術進步。

但細胞苗也仍然存在「弱點」，就是——需要使用牛睾丸細胞和牛血清進行培養，這其中就很難避免BVDV的污染。

BVDV污染疫苗影響豬瘟抗體產生

所謂BVDV，是牛病毒性腹瀉病毒Bovine viral diarrhea virus的縮寫，其除了引起牛發生黏膜性腹瀉外，還可感染包括豬在內的多種動物。BVDV與豬瘟同屬黃病毒科瘟病毒屬，根據豬體免疫攻毒試驗、瓊脂擴散試驗、中和試驗和免疫熒光試驗，已經充分證明BVDV和豬瘟病毒之間存在免疫學關係，這兩種病毒可能含有共同的可溶性抗原。一般情況下，生豬感染BVDV不表現牛病毒性腹瀉的臨床癥狀而呈現亞臨床感染，其癥狀和病理變化類似溫和型豬瘟。

而BVDV之所以是豬瘟疫苗的老問題，是因為目前來說，豬瘟疫苗的生產上通常是使用牛血清去培養細胞及病毒的，而BVDV在牛血清中又普遍存在。根據文獻記載和專家的介紹，我國牛感染BVDV幾乎達到100%，很少檢出陰性牛群。豬瘟細胞苗在生產過程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等材料，這些材料一旦細胞被污染，一來會影響豬瘟病毒的增殖，導致豬瘟病毒本身病毒含量毒價上不去；二來用這些被污染的豬瘟細胞苗給豬免疫接種，BVDV不僅會干擾豬瘟疫苗抗體的產生，造成免疫失敗；更嚴重的是，豬使用污染的疫苗後可感染BVDV， BVDV還可引起母豬繁殖障礙，病毒通過胎盤傳染給仔豬，甚至引起仔豬的發病，其臨床癥狀和病理變化與豬瘟十分相似。

此外，不僅是BVDV病毒抗原，有研究顯示即使用含有BVDV抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養，出現類似於豬瘟的臨床癥狀和病理變化。

通過檢測控制是唯一避免BVDV污染的方法

實際上，針對獸用生物製品的外源病毒污染，在2010版的《中國獸藥典》和現行的《中國獸藥典》（2015版）中，均明確寫明獸用生物製品活疫苗產品中，BVDV外源病毒是作為必檢的項目。中國獸醫藥品監察所豬瘟參考實驗室研究員王琴表示，由於BVDV不能通過任何方法從疫苗中剔除，因此只能通過對原料的控制來避免其進入豬瘟疫苗之中。所以製作豬瘟疫苗用到牛血清，必須是BVDV雙陰性的牛血清。而BVDV雙陰性的血清等材料只能通過嚴格的檢測來挑選，一旦檢出BVDV病原，則必須棄用。在成品檢測中如果檢出BVDV，也必須要報廢。

在《中國獸藥典》中，針對BVDV外源病毒的檢驗主要是通過將待檢疫苗製品接種BVDV敏感的細胞，收穫細胞培養物傳代一定代次後將細胞培養物再次接種敏感細胞通過熒光染色的方法進行檢驗。該方法檢驗周期比較長，且檢驗用細胞培養仍然要用到血清，對檢驗細胞使用的血清要求比較高，不太適用於樣品的快速檢測。那麼對於獸用活疫苗，尤其是豬瘟活疫苗產品，有沒有一種方法能夠快速、準確的做到BVDV的檢測，用於指導疫苗生產過程中的原輔料、半成品抗原乃至最後的成品抗原中BVDV外源病毒的檢測呢？

區分BVDV與豬瘟的檢測方法建立是BVDV控制難點

國內外科研工作者相繼建立了許多檢測、診斷BVDV的方法，與RT-PCR為代表的分子生物學檢測技術相比，病毒分離鑒定、熒光免疫以及血清中和試驗等方法非常耗時，不利於樣品的快速診斷。

同時，已分離鑒定的BVDV可分為3個基因型，與同屬的CSFV有抗原交叉反應，用ELISA方法也較難於做到有效區分及檢測。而RT-PCR、尤其是熒光定量RT-PCR方法既有快速、特異及敏感等諸多優點，通過引物的設計、探針類型的選擇及使用，可有效做到BVDV的快速檢測及與CSFV的鑒別檢測，現已成為BVDV快速檢測的首選方法。

但是，由於BVDV和豬瘟病毒的非常相似，其混在豬瘟活疫苗中常常使檢測「失靈」。檢測方法的特異性會受到干擾，有時候檢出來的BVDV可能是豬瘟，也有可能豬瘟活毒中藏匿的少量BVDV「逃過」檢測。因此如何對二者進行有效區分成為檢測方法建立的難點。在檢測方法的建立上需要下很大功夫，如若不然，便會導致特異性性不夠，不能做到區分兩種病原。

成都天邦研發部經理岳豐雄告訴記者，首先，是可以通過熒光定量RT-PCR方法對豬瘟活疫苗中的BVDV外源病毒做到檢測及與CSFV病毒的鑒別檢測的；第二，在這其中引物的設計是最重要的一環，引物設計的好壞將直接影響到檢測引物的靈敏性及最低檢測量。

由於BVDV分為3個基因型，且不同基因型之間的基因同源性也較低，因此可以在BVDV的5』非編碼區域設計引物位點；第三，單純通過RT-PCR進行BVDV的外源病毒檢測還達不到豬瘟活疫苗的外源病毒檢測標準，必須建立熒光定量RT-PCR方法，且探針的熒游標記基團必須使用特異性更好的MGB探針做為標記才能在提高檢測引物的靈敏度（BVDV的最低檢測劑量）的同時能夠做到對CSFV的鑒別檢驗，避免做到豬瘟活疫苗產品中BVDV外源病毒檢測中對豬瘟活疫苗的非特異性擴增。

圖1 豬瘟活疫苗BVDV熒光定量RT-PCR擴增曲線圖

圖2 RT-PCR檢測結果顯示4批穩常佳未檢出BVDV

1：穩常佳2016040批；2：穩常佳2016045批；3：穩常佳2016046批；4：2016047批陰性：陰性對照陽性：陽性對照

而據岳豐雄介紹，成都天邦目前已經建立起這種方法，經不同樣品（豬瘟脾淋苗和細胞苗中加入不同病毒含量的BVDV）的反覆檢測驗證，該檢測方法具有很好的靈敏度，能夠在豬瘟活疫苗中檢測出極低劑量的BVDV外源病毒污染，且對豬瘟病毒無非特異性的擴增。精確度可以達到1.5個TCID50，不會把疫苗中的豬瘟病毒「誤檢」為BVDV，也不會造成對豬瘟疫苗中BVDV的「漏檢」。

並且，成都天邦按照現行《中國獸藥典》對活疫苗BVDV外源病毒進行檢測外，同時利用建立BVDV熒光定量RT-PCR方法對活疫苗（尤其是豬瘟活苗）生產過程中的血清等原輔料以及半成品、成品進行快速檢測，保證了活疫苗產品的BVDV外源病毒檢測陰性。

岳豐雄還介紹，實際上早在2013年開始，天邦就將BVDV的檢測和清除方法的建立、與CSFV懸浮培養工藝開發、TCID50評活病毒含量測定價方法共同提上研發日程，經過2年的實驗和反覆驗證，終於建立了以上成熟的BVDV檢測方法。這對豬瘟疫苗的原料控制和豬瘟疫苗成品控制都有重要意義，有助於更好的控制豬瘟活疫苗中的BVDV外源病毒污染。

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