Western blot常見問題及注意事項

1

無信號或信號弱

1

抗原量不足

適當增加蛋白上樣量，或更換檢測樣本

2

抗體不足或孵育時間短

降低抗體的稀釋度，延長抗體孵育時間

3

一抗、二抗不匹配

核實抗體適用的物種信息

4

抗體保存不當或放置時間過長

更換新抗體

5

電極插反，轉膜失敗

重新操作；

6

蛋白分子量較小(

減少轉膜時間，使用小孔徑膜

7

蛋白分子量較大而轉膜時間不足

適當延長轉膜時間

8

洗膜過度

降低洗膜強度（如時間/次數/溫度）

9

濾紙、膠、膜之間有氣泡

配膠與轉膜時小心操作，防止氣泡產生

10

其他

2

背景高

1

一抗濃度過高

調整抗體稀釋比

2

封閉不充分

延長封閉時間或優化封閉條件包括封閉液，避免多張膜重疊

3

抗體孵育溫度過高：

最好調整為4℃環境下孵育

4

洗膜不充分

提高洗膜的次數和時間等

5

膜乾燥：

操作過程中應始終保持膜的濕潤（干轉除外）

6

顯色時間過長，膠片曝光時間過長

摸索合適的顯色曝光時間

7

膜沒有均勻浸濕：

轉膜前應將膜完全浸濕

8

膜或者緩衝液污染：

全程佩戴手套；更換新鮮轉膜緩衝液

9

其他

3

出現非特異性條帶

1

抗體特異性較差

選取效價高的一抗

2

蛋白上樣量過大

酌情減少上樣量

3

抗體濃度過高，孵育時間過長

降低抗體的稀釋度和孵育時間

4

洗膜不充分

適當增加洗膜的時間和次數

5

封閉效果差

更換封閉液，適當延長封閉時間

6

二抗出現非特異性結合

設立不加一抗只加二抗的平行對照

7

其他

4

其他注意事項

1

膠板、玻璃等需洗刷乾淨；

2

倒膠前兩塊玻璃板底部需對齊，防止漏膠；

3

嚴格把控AP和TEMED的加入量

4

配膠時加入試劑後需搖勻，使各組分充分混合，防止膠塊聚合不均

5

其他

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