fafa小姐姐CRISPR大講堂—新葯研發的靶點篩選I

上一周我們已經通過泓迅案例和應用案例詳細的解讀了CRISPR-Cas9應用於哺乳動物細胞基因/基因組編輯。這次課程將介紹CRISPR—Cas9在新葯研發靶點篩選的應用。

新葯研發的靶點篩選

現代新葯研發的首要任務是篩選、確定和製備有效的藥物靶點。CRISPR-Cas9在多種類型的細胞和組織中都具有高效精確的基因編輯能力，據文獻[1-3]報道，以CRISPR-Cas9為基礎的基因編輯技術在一系列藥物靶點篩選中展現出了極大的應用前景。

通過構建sgRNA文庫，利用慢病毒轉染細胞，對疾病發生、維持癌細胞生長、存活及發展等過程具有重要作用的蛋白及其結構域的大規模篩選，結合NGS及數據分析，對尋找合適的藥物作用靶點，研發新葯尤其是癌症治療藥物具有重要意義。

研究思路

服務優勢

References:

[1].Parnas, O., et al., A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks. Cell, 2015. 162(3): p. 675-86.

[2].Sanjana, N.E., Genome-scale CRISPR pooled screens. Anal Biochem, 2016.

[3].Varshney, G.K., et al., A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish. Nat Protoc,

2016. 11(12): p. 2357-2375.

應用案例1—基因敲除方法篩選與人類腫瘤生長和抗藥相關的基因

背景

目前，RNAi技術是篩選哺乳動物細胞基因組功能缺失的一種主要方法。但是RNAi技術只能通過降解mRNA的方法達到抑制基因表達的效果，無法在基因組水平通過敲除基因造成功能缺失。CRISPR-Cas9技術通過sgRNA介導Cas9蛋白，對哺乳動物基因組的特定位點產生插入/缺失的突變，造成其基因功能永久性缺失，有較好的抑制效果。因此構建慢病毒包裝的CRISPR-Cas9的高通量篩選文庫可以實現基因組範圍內的大規模功能基因的篩選。CRISPR-Cas9高通量篩選文庫可廣泛應用於人類腫瘤疾病研究中，系統的分析、驗證一些與腫瘤生長及抗藥性相關基因，篩選與腫瘤疾病治療相關的藥物靶點。

方法

1、構建單質粒載體（圖1），載體包含了Cas9基因、sgRNA基因以及Puro篩選標記，使用慢病毒包裝轉染細胞（圖2）；

圖1. 慢病毒包裝單質粒表達載體

2、針對人類基因組中18,080個基因的5』外顯子，平均每個基因設計3～4個sgRNA位點，構建含有64,751個sgRNA的文庫（圖2）；

圖2. sgRNA文庫構建及慢病毒包裝

3、為了檢測GeCKO文庫的敲除效果，採用陰性篩選檢測與細胞耐藥性相關的基因；採用陽性篩選檢測與細胞生長或生存相關的基因。高通量篩選結果的後期分析採用RIGER演算法（圖3）。

圖3. CRISPR基因敲除文庫篩選及收集、分析具有篩選表型的細胞

結論

1、陰性篩選結果顯示，GeCKO文庫篩選到某些與核糖體結構組成的相關的基因對黑色素瘤A375細胞的生長具有重要的作用；

2、陽性篩選結果顯示，除了已知的NF1和MED12基因，NF2、CUL3、TADA1和TADA2B這4個基因也參與了威羅菲尼在黑色素瘤A375細胞中的耐葯調節過程。

References:

Shalem,O.,et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166) : P. 84-7

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