Myc依賴的氧化代謝反應通過核受體ERRα調控破骨細胞的形成

背景知識

MYC（c-myc）: 原癌基因c-myc編碼轉錄因子，可調控很多基因，進而影響細胞周期演進、衰老、凋亡、代謝等生物學過程。近期有報道，RANKL 誘導破骨細胞後，Myc的表達增高，同時在未分化的巨噬細胞中沒有表達。同時，屏蔽Myc後，RANKL誘導後未能形成破骨細胞。因此，表明RANKL能夠介導MYC，並對RANKL誘導的破骨細胞形成及功能有重要作用。

同時作者在前期發現，MYC能夠直接調控NFATc1，但是MYC在破骨細胞具體的分子機制尚不清楚。（這是作者為什麼選擇研究MYC的原因）

對於RANKL誘導破骨細胞分化的主要機制，RANKL與其受體RANK結合後，激活一系列信號通路，比如MAPK，NF-kB等，從而激活重要的轉錄因子NFATc1，最終激活破骨細胞特異性基因表達，如CTSK，TRAcP等，導致破骨細胞形成及發揮骨吸收功能。

然而，經過研究發現，NFATc1並不是唯一的破骨細胞分化的最終轉錄因子，在RANKL介導的信號途徑中，還存在其他的調節因子。（這是作者埋下的一個伏筆）

破骨細胞發生骨吸收過程是發生一種能量需求的過程。破骨細胞含有大量的線粒體，破骨細胞分化通過線粒體呼吸為其代謝活動提供能量。

最近研究發現PGC-1beta （過氧化物酶增殖激活受體?輔助激活因子1beta）,其為線粒體功能呼吸生成的調節因子。

糖酵解與谷氨醯胺代謝，為破骨細胞分化及發揮功能主要來源，其中MYC是代謝過程中重要的轉錄因子之一。

綜上所述，本文通過提出幾個假設作為整篇故事敘述的串聯點：

1. MYC在破骨細胞形成的分子及細胞機制具有重要作用。

2. 破骨細胞含有大量線粒體，其形成需要能量主要來源於線粒體呼吸，而MYC在線粒體生物學功能（有氧呼吸：糖酵解到氧化磷酸化到三羧酸循環）中具有重要作用，MYC扮演關鍵調節因子串聯兩者關係。

3. 在破骨細胞分化過程中，通過MYC/ERRa信號通路調控能量代謝，從而影響骨量變化。

4. 最終為了進一步將基礎研究臨床轉化應用，將MYC下游的靶點ERRa作為未來藥物治療骨丟失疾病的潛在治療方案。

正文解讀

首先作者介紹了為什麼要選擇研究MYC？

Supplemental Fig.1 A與B圖：分別選用人源與鼠源破骨細胞前體，通過RANKL在不同時間點刺激，檢測MYC在破骨細胞分化中的表達，結果發現MYC主要是在破骨細胞分化早期有明顯表達。其中還發現MYC表達高峰時間24h，NFATc1的表達也相應表達明顯。這也驗證了作者在前期研究結果，MYC能夠直接調控NFATc1的結果。

這是個切入點，因為MYC在正常細胞種表達很低，只在腫瘤形成過程中異常表達。然而作者發現，在破骨細胞早期形成過程中的表達迅速升高，也是為什麼選擇MYC作為在破骨細胞中研究的原因。

為了進一步檢測MYC在骨重建過程中的作用，鑒於MYC在OCP分化早期高表達，利用Lysm-cre進行cKO。

首先針對雄性小鼠進行條件性敲除

Figure1 A圖：μCT掃描分析骨組織松質骨中的變化，發現與MYCWT相比，MYCM骨量增加。

Figure1 B圖：進一步統計學分析，與MYCWT相比，MYCM BV/TV，Tb.N參數有統計學意義，但是從他的統計學處理方式，可以看出來，個人覺得phenotype也不是特別好。

然後針對雌性小鼠進行條件性敲除

Supplemental Fig.2 A：μCT掃描分析，與MYCWT相比，MYCM骨量增加。

Supplemental Fig.2 B：統計學分析，與MYCWT相比，MYCM BV/TV，Tb.N參數有統計學意義。

Supplemental Fig.2 C：雌雄體重沒有明顯變化。

接下來是骨組織免疫組化，進一步針對性的檢查cKO小鼠骨組織中破骨細胞數量等變化。

Figure1 C圖：發現與MYCWT相比，MYCM中TRAcP染色面積減少，骨侵蝕面積也減少。

Figure1 D圖：進一步統計學分析，與MYCWT相比，MYCM N。Oc/BS等明顯降低。

隨後體外實驗，通過分離敲除小鼠中的破骨細胞前體，利用RANKL誘導分化，檢測MYC對破骨細胞分化及功能的影響。

首先，Supplemental Fig.3A,B圖：作者對MYC特異性敲除小鼠中，進一步從mRNA與蛋白水平證明MYC MYC敲除效率。

接下來， Figure2 A圖 ：TRAcP染色，定性及定量分析破骨細胞分化情況。發現與MYCWT相比，MYCM中提取的OCPs,經RANKL誘導分化後，破骨細胞數量及大小顯著性抑制。表明MYC表達的變化可能影響破骨細胞分化。

Figure2 B圖 ：羥基磷灰石骨板模擬骨吸收實驗，定性定量破骨細胞骨吸收功能的作用。發現與MYCWT相比，MYCM中提取的BMMs,經RANKL誘導分化後，破骨細胞骨吸收面積及數量顯著性抑制。表明MYC表達的變化可能影響破骨細胞功能。

Figure2 C圖：利用q-PCR檢測破骨細胞特異性基因的變化。發現與MYCWT相比，MYCM中提取的OCPs,經RANKL誘導分化後，破骨細胞特異性基因Itgb3，Ctsk，Dcstamp等顯著性降低。表明MYC表達的變化也影響破骨細胞特異性基因的表達。

上述體內敲除MYC引起高骨量表型及破骨細胞功能試驗表明，MYC在骨重建過程中具有重要作用。

基於上述，作者利用病毒過表達MYC進行挽救實驗。

Figure2 D圖：TRAcP染色，定性定量破骨細胞分化情況。通過對MYCWT與MYCM中OCPs進行病毒轉染至過表達MYC。發現通過過表達MYC，能夠顯著促進破骨細胞數量及大小。表明破骨細胞形成能力的變化與MYC表達的缺失與否有重要聯繫。

MOCK是空載體轉染，做陰性對照。

因此，就以上實驗結果，作者首先考慮MYC表達的缺失引起破骨細胞形成能力的下降，是否與破骨細胞前體的數量及增殖能力下降有關。

Supplemental Fig.4A,B圖：檢測MYCWT與MYCM中OCPs的數量變化情況，結果發現沒有顯著性差異，表明MYC表達的缺失引起的破骨細胞形成能力的下降，與破骨細胞前體數量沒有關係。

Supplemental Fig.4C,D圖：檢測MYCWT與MYCM中OCPs的增殖情況的變化，結果發現，與MYCWT相比，MYCM中OCPs的增殖降低，但是幅度較小。

因此，破骨細胞前體數量及增殖角度不是MYC缺失引起破骨細胞分化受阻的主要原因。

此外，Supplemental Fig.5 A,B圖：體外實驗表明，MYC表達的缺失並未影響RANK的表達及RANKL介導的信號通路的激活。這可以推測RANKL介導的MYC可能是通過別的信號途徑去調控這一生理現象的變化。

因此，基於以上MYC在破骨細胞中的探討，表明RANKL介導的MYC在破骨細胞分化過程中扮演重要角色。

接下來作者將對MYC在破骨細胞分化中如何進行調控做具體解釋。

Figure2 C,E 圖：作者針對敲除模型，對前期研究MYC直接調控NFATc1進一步做驗證，說明MYC能夠直接從mRNA與蛋白水平調節NFATc1的表達。

（這個數據可能是為了接下來的做個鋪墊）

作者因此推測是否能夠通過聚集NFATc1活性，補償MYC的缺失引起的破骨細胞形成。

首先通過轉入Ca-NFATc1持續激活NFATc1活性，告訴大家其轉入效率。

從Supplemental Fig.6證明轉入效率。

然而，從Figure2 F發現：持續的激活NFATc1並未能補救因MYC的缺失引起的破骨細胞形成。

這表明NFATc1並不是MYC唯一下游調控的基因，MYC還有可能通過調控其他通路，並結合NFATc1從而來影響破骨細胞形成。

因此，為了進一步探討RANKL介導MYC調控破骨細胞形成的信號通路，作者使用高通量RNA測序（轉錄組測序）進行篩選。首先，進行樣本及方法學的考察。 Supplemental Fig.7 表明樣本重複性較好，不會因誤差導致出現差異性基因即假陽性。

接下來，作者選擇MYCWT與MYCM中OCPs，進行轉錄組測序。

Figure3 A：發現敲除MYC後，與MYCWT 中比較，通過RANKL刺激破骨細胞前體48h後，能夠介導1068個基因（藍色區域），同時有1445個基因受到抑制（紅色）。

並對這些數據進行富集GSEA（生物信息學方法）。

當然數據富集，必須擁有相應的資料庫及處理手段，文章中選用了MSigDB, Ingenuity Pathway Analysis等方法。Figure3 B：GSEA富集結果。綠色曲線代表富集曲線。縱坐標是富集程度，橫坐標代表不同情況的樣本，比如MYCWT>MYCM即主要是以MYC未敲除的對象為主； MYCWT

Table1與Supplemental Fig.8: 發現，MYC相關的基因主要與三羧酸循環，氧化磷酸化等信號通路相關。其中看到p值越小，說明相關性越密切。

這也與MYC在破骨細胞分化過程中，能量代謝過程中起著關鍵作用相呼應，也是作者為後續埋下的伏筆。

Supplemental Fig.8: OCPs缺失MYC後，在RANKL刺激48h後，相關基因受到抑制

上述總結，表明MYC在OCPs的缺失, 通過RANKL誘導刺激，利用轉錄組測序發現，與氧化磷酸化通路相關性最明顯，且是負相關。

接下來作者針對轉錄組測序中與氧化磷酸化通路相關基因進行熱力圖繪製。

Figure3 C：與MYCWT相比，MYC的缺失，氧化磷酸化基因受到明顯抑制。（藍色代表抑制，紅色代表促進）

Complex I-V分別是以下：氧化磷酸化五個呼吸酶複合體：NADH-輔酶Q氧化還原酶（複合體I）；琥珀酸-Q氧化還原酶（複合體II）；電子傳遞黃素蛋白-Q氧化還原酶；Q-細胞色素c氧化還原酶（複合體III）；細胞色素c氧化酶（複合體IV）；替代的還原酶和氧化酶（複合體V）；

鑒於近期研究發現，氧化磷酸化提供了破骨細胞形成所需的能量。但是具體的調控機制尚不明確。基於MYC與糖酵解、谷氨醯胺代謝有密切聯繫。因此，作者提出假設，MYC是通過調節線粒體有氧呼吸，從而介導RANKL激活破骨細胞形成。

為了驗證假說，作者首先檢測MYCWT與MYCM中OCPs，經RANKL刺激後，線粒體功能的變化。

作者首先想到觀察線粒體耗氧率（OCR）。

我們先看Supplemental Fig.9: 如何去分析線粒體耗氧率。

寡黴素（oligomycin），魚藤酮（Rotenone）及抗黴素A（Antimycin A）是線粒體抑制劑。FCCP是陽性化合物，促進線粒體功能作用。

Supplemental Fig.9：在加oligo之前顯示的數值，代表的是細胞的基礎耗氧量，包括線粒體氧化磷酸化及質子漏耗氧。即質子在線粒體膜通過呼吸鏈形成電勢能後，一部分質子迴流可以通過ATP合酶形成ATP，將勢能轉化為ATP中的能量。一部分通過線粒體膜但是只是發生氧化，勢能轉化為熱量，但是沒有用於合成ATP。oligo是ATP合酶抑制劑，加入此葯後減少的耗氧代表的是機體用於ATP合成的耗氧量，間接顯示此時細胞的ATP產量。FCCP是一種3ATP，FCCP後耗氧的增加，代表線粒體的最大耗氧能力，間接顯示最大的呼吸能力，而其相對與基礎值的高值代表其還具有的呼吸潛力。最後加入是抗黴素A和寡黴素，二者是呼吸鏈抑制劑，完全阻止線粒體耗氧。

接下來，我們看Fig.3D,E：分別以MYCWT/MYCM+M-CSF做對照，結果顯示，當RANKL刺激後，MYCWT+RANKL組細胞的基礎耗氧率明顯升高。表明RANKL刺激線粒體呼吸功能。

然而，相比MYCM+RANKL組細胞的基礎耗氧率、ATP產量，線粒體最大耗氧能力明顯下降。

這表明MYC的缺失對線粒體生物學功能有影響。

針對上述討論，作者推測MYC在OCPs的作用是否與引起線粒體的數量變化有關。

Fig.3 F：與MYCWT/MYCM+M-CSF做對照，結果顯示，當RANKL刺激後，MYCWTT/MYCM+RANKL中線粒體數量明顯增加，表明RANKL激活破骨細胞形成，能夠促進線粒體數量增加。但是MYCWTT與MYCM之間的線粒體數量沒有明顯變化。表明MYC在OCPs的作用是否與引起線粒體的數量沒有明顯聯繫。

然而，有趣的是，Fig.3 G: 通過將MYC轉至MYC缺失的OCPs中後，MYCM+M-CSF組以及MYCM+RANKL組，細胞的基礎耗氧率明顯升高。這表明MYC直接參与，並促進線粒體呼吸功能。

同時，作者在Supplemental Fig.10(A+B)中又進一步的說明能量代謝在破骨細胞形成的重要性。通過加入糖酵解、谷氨醯胺代謝及線粒體ATP合成抑制劑後，RANKL誘導OCPs成破骨細胞後，TRAcP染色，發現破骨細胞數量及大小顯著性降低。

因此，基於上述，表明MYC是RANKL激活線粒體呼吸功能的重要的調節因子，用於提供破骨細胞形成所需的能量。

接下來，作者開始針對MYC如何進行調節線粒體與破骨細胞形成之間的聯繫。

作者開始回歸到最初的發現，因為MYC在正常細胞種表達很低，只在腫瘤形成過程中異常表達。然而作者發現，在破骨細胞早期形成過程中的表達迅速升高，其實這也是這篇文章的切入點。根據這個發現，作者提出假設，MYC介導下游的轉錄因子，從而直接激活破骨細胞特異性基因，最終激活破骨細胞分化。

為了去篩查這些轉錄因子，Table2. 作者利用生物信息學對MYC依賴且RANKL介導的基因進行富集，發現SP1,Esrra等基因。

值得注意的是，Fig.4 A：作者發現,與MYCWT相比，RANKL刺激MYCM中OCPs後，只有MYC與Esrra具有顯著下降。表明Esrra在破骨細胞分化過程中受到調控。

ERRa 是雌激素受體，也是ERRa是線粒體特異性基因，在骨代謝、能量代謝及乳腺癌發生中起著重要作用。同時也能間接促進破骨細胞分化（PGC-1beta依賴，激活ERRa的因子），通過PPARy引起ERRa表達，促進線粒體活性，促進ROS，NFATc1，到促進破骨細胞分化。

但是MYC與ERRa之間的聯繫沒有被報道。

Esrra 是編碼ERRa的基因。因此，Fig.4B與C, Supplemental Fig.11(A+B)，分別從mRNA與蛋白水平，並選用人源及鼠源的破骨細胞前體細胞檢測，結果顯示：與MYCWT相比，通過RANKL刺激MYCM中OCPs後，Esrra與ERRa的表達明顯下降。同時與ERRa相互促進激活的蛋白PGC1beta的表達也明顯下降。

作者為了進一步驗證MYC與ERRa的關係，Supplemental Fig.11 C,與對照組相比，利用siRNA進行沉默MYC後，結果顯示，Esrra與NFATc1的表達增高。

Supplemental Fig.11 D, 利用siRNA進行沉默MYC後，人單核細胞的破骨形成能力也受到顯著抑制。

同理，Fig 4D,作者在MYCWT與MYCM中OCPs進行過表達MYC, ERRa與PGC-1beta的表達明顯增高。這表明ERRa依賴於MYC活性。同時作為激活ERRa的PGC-1beta的表達，卻沒有任何改變，結合Fig4 C中PGC-1beta表達的變化。這更加證明了ERRa依賴於MYC活性。

隨後，Supplemental Fig.12 A，作者利用轉錄組測序，進一步驗證MYC與Essra的關係。通過與MYCWT相比，MYC的缺失，Essra基因受到明顯抑制。

Supplemental Fig.12 B，同時還利用Ch-Ip(分析一種已知蛋白（轉錄因子）的靶基因)。發現當RANKL刺激後，Esrra的表達水平升高，證明Esrra是MYC的靶基因。

Supplemental Fig.12 C，還利用熒光素酶報告基因技術，將ERRa-熒光素酶報告基因載體轉入RAW264.7(可作為破骨細胞前體，能夠用RANKL誘導成破骨細胞的細胞株)，同時利用Pgl3-basic空載體作為對照。利用MYC抑制劑（10058-F4）進行干預，以DMSO處理組作為對照，結果顯示ERRa的熒光信號顯著下降。

綜上，在破骨細胞形成過程中，MYC直接調控ERRa。

接下來，Supplemental Fig.13 and 14 A，作者進一步選用人源OCP以及鼠源OCP，分別在RANKL刺激下，用ERRa抑制劑XCT790干預，結果發現XCT790能顯著抑制破骨細胞分化，表明ERRa在破骨細胞分化具有重要作用。

同時，作者為進一步檢測MYC與ERRa的關係。Fig 5A,將MYCWT與MYCM中OCPs進行MYC補救實驗，進行了ERRa抑制劑處理。結果顯示，XCT790處理後，外源性MYC未能補救破骨細胞分化。表明MYC與ERRa在破骨細胞分化過程中有聯繫，並且MYC調節破骨細胞分化需要ERRa的參與。

為進一步檢測ERRa對MYC在破骨細胞線粒體功能的影響。構建了Erra在破骨細胞前體的敲除小鼠Esrra-/-。Fig 5B, C,通過分別以Esrra+/+/Esrra-/-+M-CSF做對照，Esrra+/++RANKL組細胞的基礎耗氧率明顯升高，表明RANKL刺激線粒體呼吸功能。然而，相比於Esrra+/++RANKL組，Esrra-/-+RANKL組基礎耗氧率、ATP產量，線粒體最大耗氧能力明顯下降。這表明，Esrra在破骨細胞前體的缺失影響了線粒體生物功能活性。

綜上所述，RANKL介導的線粒體生物功能活性與MYC/ERRa信號通路有密切聯繫。

作者為了進一步探索ERRa在破骨細胞形成過程中的作用。Supplemental Fig.15 B

通過病毒轉染引起ERRa過表達。然而，Supplemental Fig.15 A，結果顯示ERRa 卻不能挽救

因MYC的缺失，引起破骨細胞數量及大小的下降。

因此，這與Fig.2 NFATc1過表達的結果類似。

然而，作者進一步檢測ERRa與NFATc1的關係。Supplemental Fig.15 C，在Erra在破骨細胞前體的敲除小鼠Esrra-/-中 提取OCP,利用RANKL誘導，結果發現，NFATc1依舊有表達。這說明ERRa與NFATc1表達沒有很大關係，兩者不存在依賴關係。

因此，作者推測MYC介導的破骨細胞形成可能需要ERRa與NFATc1共同參與。

Fig.5 E，通過同時將ERRa與NFATc1共同在MYCM中OCPs過表達，發現能夠促進破骨細胞形成，達到挽救效果。

因此，結果表明ERRa與NFATc1是共同參與，並直接調控破骨細胞形成。

接下來，作者針對MYC/ERRa這條信號通路，針對去卵巢小鼠骨質疏鬆症骨丟失模型，開展靶標治療作用研究，也就是轉化應用的實驗探索。

Fig 6A, 小鼠在13w行雙側卵巢切除，恢復6W後，於19W處死，取股骨CT掃描。

Fig 6B與C,結果顯示與MYCWT 中（Sham組）比較，MYCWT （OVX組），骨小梁密度降低。然而，MYCM 中（Sham組）比較，MYCM （OVX組），骨小梁密度升高。

Fig 6D,針對破骨細胞數量進行統計，也發現MYCWT 中（OVX組）比較，MYCM （OVX組）破骨細胞數量明顯下降。這表明MYC的敲除能夠保護OVX引起的骨丟失。

因此，作者針對這MYC的特性，設計模擬藥物治療實驗。

考慮到MYC結構特性，難以設計小分子抑制物。因此，選擇其下游靶點ERRa抑制劑XCT790。

Fig 7A, 藥物治療策略。11w行雙側卵巢切除，小鼠恢復3W後，給葯6W，處死取材後進行CT掃描。

這篇文章選用的C3H mice（具有高骨量的表型）與CD-1（具有低骨量的表型）進行藥物治療。

Fig 7B,C， 選用C3H mice（具有高骨量的表型）作為研究對象，結果顯示與Sham組比較，OVX後，骨量明顯下降，骨小梁密度、數量等明顯下降。然而，針對 OVX小鼠行XCT790藥物治療後，能夠保護骨丟失。

Fig 7D,E， 選用CD-1（具有低骨量的表型）作為研究對象，結果顯示與Sham組比較，OVX後，骨量明顯下降，骨小梁密度、數量等明顯下降。然而，針對OVX小鼠行XCT790藥物治療後，能夠保護骨丟失。

上述兩個不同骨量表型進行OVX後，行XC790治療，表明XC790是潛在的治療骨質疏鬆症的藥物。

同時，作者還檢測了XCT790對體內成骨細胞形成的影響。Supplemental Fig.17A,B 與對照組比較，對骨量、骨小梁的相關參數沒有任何影響。

Supplemental Fig.17C骨組織的熒游標記（鈣黃綠素）, 成骨細胞在骨重建過程中，參與了骨基質的形成和骨礦化過程，通過骨組織的熒游標記可以觀察動態過程。綠色熒光代表沉積在骨表面的鈣黃綠素標記，通過熒游標記周長百分率或兩次以上熒游標記之間的距離，判斷在這段時間骨形成的情況和骨形成的速率。

結果顯示，與對照組比較，證明XCT790對成骨細胞骨形成速率沒有影響。

Supplemental Fig.17D顯示，與對照組比較，骨形成速率、礦化沉積率的相關參數

Supplemental Fig.17E-I最後對頭蓋骨提取的成骨細胞進行XCT790干預，利用ALP，茜素紅檢測成骨細胞形成及礦化能力，同時還檢測了成骨細胞形成的轉錄因子Runx2的表達，結果發現，與對照組相比，XCT790藥物處理組對成骨細胞形成及礦化作用沒有作用。

最後文章總結，MYC/ERRa是骨吸收，特別是與MYC表達相關的破骨細胞前體細胞相關疾病有治療作用，是未來治療的靶點。

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