撥雲見日——揭開第三代測序技術的神秘面紗

哈嘍，各位看官，對於基因測序相信大家已經有所接觸。從1977年第一代DNA 測序技術（Sanger 雙脫氧鏈終止法）開始，人們邁出對基因結構探索的腳步。到2001年，完成首個人類基因組圖譜，人類開始真正認識自我。為了降低測序費用、增加測序通量、提高測序速度，第二代測序隨之產生，但是短讀長是它的先天缺陷，無法跨越高重複區域、高複雜程度的基因。人們為了追求更長讀長，腳步沒有一刻的歇息，第三代測序技術應運而生，接下來小編將會為您撥開第三代測序的神秘面紗，看清第三代測序的真相。

原理介紹

第三代測序技術是指單分子測序技術，對於DNA 樣本不需要經過PCR 擴增，實現了對每一條DNA 分子的單獨測序。基本原理：當DNA 模板被聚合酶捕獲後，4 種不同熒游標記的dNTP 通過布朗運動隨機進入檢測區域並與聚合酶結合，與模板匹配的鹼基生成化學鍵的時間遠遠長於其他鹼基停留的時間。因此統計熒光信號存在時間的長短，可區分匹配的鹼基與游離鹼基。通過統計4 種熒光信號與時間的關係，即可測定DNA 模板序列。

圖1 測序原理示意圖

關鍵技術

ZMW（zero-mode waveguides，零模波導孔）：就像微波爐壁上可看到有很多密集的小孔，小孔直徑很有考究，如果直徑大於微波波長，能量就會穿透面板泄露。如果孔徑小于波長，能量不會輻射外部，可起保護作用。同理，在一個反應管中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導孔），外徑100多納米，比檢測激光波長小（數百納米），激光從底部打上去後不能穿透小孔進入上方溶液區，能量被限制在一個小範圍（體積20X10-21L），正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個小反應區域，孔外游離的核苷酸單體依然留在黑暗中，將背景降到最低。

圖2 ZMW示意圖

熒游標記的脫氧核苷酸 ：將熒光染料標記在核苷酸的磷酸鏈而不是鹼基上，當核苷酸摻入到新生的鏈中，標記基團就會自動脫落，減少了DNA 合成的空間位阻，維持DNA 鏈連續合成，延長了測序讀長。

圖3 熒游標記的脫氧核苷酸示意圖

優勢

超長讀長：PacBio Sequel平台最大讀長能達到70kb，平均讀長12~15kb，能夠完美跨越高重複區域和高複雜區域，減少拼接成本。

無GC偏好性：對於DNA 樣本，無需PCR 擴增，避免了覆蓋度不均一和PCR 冗餘，完全跨過高GC 含量區域，保證序列的均勻覆蓋度。

直接檢測鹼基修飾：根據不同類型的修飾鹼基具有不同的DNA 聚合酶動力學特徵，直接判斷鹼基的甲基化類型。

較短的運行時間：每個SMRT Cell 運行時間可選擇30分鐘到6小時之間，運行時間靈活。

應用方向

全長轉錄組：藉助其超長讀長，無需拼接，直接獲得包含5』，3』 末端，poly A tail 的完整轉錄本，從而準確辨別二代測序無法識別的同源異構體，同源基因、超家族基因或等位基因表達的轉錄本，同時還可以藉助二代測序數據，進行轉錄本特異性表達分析，獲得更加全面的注釋信息。

全基因組測序：由於具有讀長長的特點，在基因組測序中能降低測序後的Contig 數量，明顯減少後續的基因組拼接和注釋的工作量，節省大量的時間。

目標區域測序：目標區域測序能夠提高變異發現率和降低檢測成本，可以應用到人類疾病、植物、動物、微生物和傳染病遺傳變異的研究，能夠得到相關目標區域的完整結構。

甲基化研究：第三代測序採用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測，聚合酶合成每一個鹼基，都有一個時間段，而當模板鹼基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，當相鄰兩個鹼基的脈衝峰之間的距離和參考序列之間的距離的比值大於1時，就可以推斷這個位置有修飾。

突變鑒定（SNP檢測）：第三代測序無需PCR 擴增，沒有擴增引入的鹼基錯誤，具有不可比擬的解析度優勢，對於混合群體中低至 1/100的稀有突變都可以檢出。

宏基因組測序：利用超長讀長能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等環境中微生物的種類，能夠更加快捷地獲得更多微生物物種的全基因組序列。

全長擴增子：16S rDNA 長度大約為1540bp，利用第三代測序超長讀長優勢可以成功獲得16S的全長序列。

通過小編以上的介紹，相信大家已經對三代測序有了一些了解，目前南京揚子國資投資集團投資購買並委託南京諾禾致源生物科技有限公司運行的PacBio Sequel 測序平台已經穩定運轉，可為老師提供通量更高、周期更短、信息分析更全面的第三代測序服務。

三代測序業務線 史 旺丨文案

戴淑玲丨編輯

配圖來源於網路，侵刪

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