水稻中轉錄因子等位基因與廣譜抗性

背景

1 除了細胞免疫系統外，植物的先天免疫應答主要包括兩部分發內容：病原體相關分子模式（PAMP）免疫（PTI）和效應器觸發免疫（ETI）。

2 PTI反映包括MAP激酶的激活，活性氧ROS的誘導，胼胝沉積和誘導疾病相關基因等生物過程。

3 病原體向植物細胞遞送效應物以抑制宿主PTI反應和/或產生有利的宿主細胞環境。植物由含有核苷酸結合域-亮氨酸抗性基因編碼的包內感測器重複，起感知導致ETI的病原體效應物。

4 到目前為止，只有6個基因被發現存在廣譜抗性：擬南芥RPW8.2，水稻STV11、小麥的Lr34、Yr36，水稻pi21和大麥mlo。其中有些基因已經在育種中使用。

5 水稻稻瘟病是水稻最具破壞性的疾病，大大降低了產量和籽粒品質，嚴重時可減產30%~50，甚至顆粒無收

6 Digu水稻是一種對稻瘟病高抗性的水稻品種。

方法

1 對水稻Digu，從網路下載66個水稻的原始數據進行分析，每個樣品進行變異檢測後，對Digu特異性的SNP，特別是在CDS區和啟動子區域1.5kb範圍內進行篩選。變異監測軟體：bwa+picard+gatk。

2 一系列生理生化實驗，研究基因Bsr-d1的功能

結果

1 將Digu和66個已經發表的水稻材料進行比較，發現了Digu中存在獨有的2576個SNP位點，其中由30個非同義的SNP，存在於25個基因的外顯子中。6個SNP是在基因的1.5kb啟動子區的，將這些標記設計為dCAPS進行後續分析

2 將Digu與高易感的LTH品種進行雜交生成重組自交系，對重組自交系的性狀和SNP標記進行關聯分析，確定了SNP33與稻瘟病的抗性直接相關，該SNP位於LOC_OS-3g3223（bsr-d1）的啟動子區域。但是經由PCR的測序結果反映該基因雖然在啟動茲區域21個單鹼基變化和兩個INDEL，但是在CDS區沒有顯著差異。

3 在不同的品系中對bsr-d1進行接種前後的表達水平鑒定，有趣的是在接種前，抗性材料digu的表達是感性材料LTH的1/2，在接種後，LTH是Digu的8倍以上。因此，較低的Bsr-d1與易感性直接相關，且通過胚芽接種誘導感性材料，而不是抗性材料。在其他材料中的驗證結果也基本一致，所有抗性的材料bsr-d1的表達均被抑制；

4 利用RNA干擾技術在TP309水稻中使Bsr-d1基因過表達或者沉默，得到了8個Bsr-d1的RNA干擾系。干擾系1和2使Bsr-d1的基因表達降低到了野生型的35%，在接種之後，干擾系材料幾乎不感染稻瘟病。而過表達的材料提高了稻瘟病的感染情況。利用CrisPR/cas9技術對Bsr-d1的敲出了一部分序列（2*20nt），同時也發現了較強的抗病性

5 為了評估BSR-d1對性狀的參與程度，將Bsr-d1的敲出系材料與9種感性材料進行比較，兩種敲出材料均顯示了較高的抗性。通過接種後菌絲的生長狀況進行分析，在36h後開始變弱，並在48h時消失。確認Bsr-d1的敲出會影響稻瘟病的早期生長。使用3,30-二氨基-乙腈（DAB）對葉細胞進行染色體反映，在敲出系種，會由更多的雙氧水釋放，因此ROS的突發升高是Bsr-d1介導的免疫力的一部分。

6 雖然在Bsr-d1的啟動子區域之間由21個SNP，但是在轉錄因子結合的區域中只有2個SNP位於兩個表達MYB轉錄因子的結合位點。MYB的轉錄因子可能在抗性和感性材料中差異的表達而影響了Bsr-d1的基因的表達。在接種後，MYB的4種轉錄因子種，一種下調，四種上調。在酵母的單雜系統中，下調的MYB轉錄因子（MYBS1）抑制了酵母細胞的生長。表明MYBS1與Bsr-d1的啟動子結合并抑制其表達。利用電泳遷移率實驗發現，MYBS1在野生型LTH中結合Bsr-d1的啟動子的親和力要比突變型高的多`

7 之後的研究中，將Mybs1進行敲出後，發現Mybs1的敲出材料均產生了更高的感染率，菌絲的生長速度也大大加快了，同時也抑制了活性氧的產生，發現BSR-d1的RNA水平提高了4~5被。而Bsr-d1的靶向基因的表達也有了顯著的提高。而在Digu和LTH中發現，Mybs1的RNA表達水平在接種後48小時內沒有明顯差異，因此並非是感染誘導的。

8 稻瘟病通過誘導Bsr-d1基因的表達抑制宿主免疫，而BSR-D1和MYBS1均是調節植物免疫力的轉錄因子，可以在之後的育種和研究中通乳應用。

A Natural Allele of a Transcription Factor in RiceConfers Broad-Spectrum Blast Resistance, Cell, doi:10.1016/j.cell.2017.06.008

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