DNA抽提基本原理問答

DNA抽提基本原理問答

酚/氯仿法提取DNA是DNA抽提的經典方法，也是基本方法。各種商品化DNA提取試劑盒，絕大部分在此基礎上衍生、發展而成。掌握酚/氯仿法的基本原理，不但有助於理解DNA抽提的標準操作流程(SOP)，而且有助於故障排除，有助於優質地完成工作。所有從事分子生物學工作的同學，都有必要對這一方法有透徹的理解。

1、用酚/氯仿法抽提DNA時，苯酚起什麼作用？

用苯酚處理各種樣本勻漿液時，由於組蛋白與DNA之間的聯鍵已經斷裂，蛋白質分子表面又含有很多極性基團，與苯酚相似相溶，所以蛋白質分子溶於酚相。DNA分子溶於水相。

在DNA提取過程中，苯酚的作用是：第一，使蛋白質變性；第二，抑制細胞破裂時所釋放出來的DNase的活性，抑制DNase對DNA的降解。

苯酚的缺點有：第一，苯酚能溶解10%-15%的水，從而溶解一部分DNA，造成部分DNA被損失。2，苯酚不能完全抑制DNase的活性，導致部分DNA被降解。

2、氯仿起什麼作用？

第一，氯仿能夠幫助克服上面提到的酚的兩個缺點，幫助提取更多更好質量的DNA；第二，氯仿能加速有機相與水相的分層，方便操作。

由於酚易溶於氯仿，在酚/氯仿抽提後，再用氯仿抽提一次，可以去除核酸溶液中殘留的的痕量酚。

酚和氯仿都是非極性分子，水是極性分子。當蛋白質水溶液與酚/氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度大，與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分離。而酚、氯仿等有機溶劑的比重更大，位於最下層。

作為蛋白質變性劑的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有所長，各有所短。酚的變性作用更強烈，但是酚與水有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA。氯仿的變性作用比酚弱，但是氯仿與水不相溶，不會帶走DNA。所以在抽提DNA的過程中，酚與氯仿混合使用效果最好。

經第一次酚抽提後，水相中殘留有酚。利用酚與氯仿互溶的性質，可以用氯仿進行第二次抽提，一方面進一步變性蛋白質，一方面將殘留的酚帶走。第二次抽提時，也可以將酚與氯仿混合（1:1）使用。

3、為什麼要在酚/氯仿中加入少量異戊醇？

第一，異戊醇可以降低表面張力，減少氣泡的產生。在DNA抽提過程中，為了使有機溶劑與樣本裂解液儘可能地混合均勻，必須劇烈振蕩數次。這時容易在混合液內產生氣泡，氣泡又會阻止有機溶劑與蛋白質之間的充分接觸和相互作用。在酚/氯仿溶液中加入少許異戊醇，能夠降低表面張力，減少抽提過程中泡沫的產生，使酚/氯仿能夠更容易、更充分地與樣本裂解液中的蛋白質接觸，更好地發揮蛋白質變性和酶活性抑制作用。一般採用氯仿：異戊醇比例24：1，也可以採用酚：氯仿：異戊醇比例25：24：1（不必事先配製，臨用前一份酚加一份24：1的氯仿：異戊醇）。

第二，異戊醇有助於分相，有助於維持離心後上層含DNA水相、中間層變性蛋白相、下層有機溶劑相的穩定分層。

4、為什麼要用無水乙醇沉澱DNA？

無水乙醇是最常用的DNA沉澱劑。DNA溶液中的DNA分子以水合物的狀態穩定存在。加入乙醇後，乙醇奪取DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於相互聚合，形成沉澱。乙醇的優點是，1、可以以任意比例與水混溶；2、乙醇與核酸不起任何化學反應，對DNA很安全，所以乙醇是理想的DNA沉澱劑。

實驗中，通常加入2.5倍體積的無水乙醇與DNA溶液相混合，乙醇的終含量為71.4％。由於無水乙醇的價格比95％乙醇貴很多，經常有實驗室改用95％乙醇，乙醇的終含量下降為67.9％，沉澱效果稍差，DNA的損失增大。在多次用乙醇反覆沉澱以純化DNA的時候，會影響DNA得率。可以考慮一種折中的做法：初次沉澱用95％乙醇，第二次沉澱用無水乙醇。

5、用乙醇沉澱DNA時，為什麼要加入一價陽離子？

用乙醇沉澱DNA時，通常要在溶液中加入單價陽離子，如少量3 M NaCl或NaAc。Na+能中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間由於同性電荷而形成的排斥力，使DNA分子更容易聚集形成沉澱。

所加入的單價陽離子，濃度不可過高也不可過低。如果加入的鹽溶液濃度太低，只有部分DNA生成DNA鈉鹽而聚合，則DNA沉澱不完全。如果加入的鹽溶液濃度太高，導致最終獲得的DNA產品中鹽雜質過多，則影響後續的PCR、DNA酶切等生化反應。出現這種情況，可以通過對DNA進行洗滌或重沉澱來純化。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！