遺傳性眼病致病基因突變分析中應重視臨床表型的評估

專家述評

【專家述評】遺傳性眼病致病基因突變分析中應重視臨床表型的評估

李楊

100730北京，首都醫科大學附屬北京同仁醫院 北京同仁眼科中心 北京市眼科研究所 眼科學與視覺科學北京市重點實驗室

通信作者：李楊

Email：yanglibio@aliyun.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.08.001

【摘要】一代測序（Sanger測序）技術可對候選基因進行測序分析，其測序讀長較長，準確性高，是過去三四十年間常用的基因突變分析方法，但因其存在測序通量小及成本高等缺點，限制了其在具有高度遺傳異質性疾病及大樣本量基因突變分析中的應用。二代測序（NGS）技術是2005年以來發展起來的在臨床上廣泛應用的基因測序技術，測序通量高，費用較低，自動化程度高，為遺傳性眼病的基因診斷帶來了很大的便利。但實際上，單基因遺傳性眼病具有高度遺傳異質性和臨床異質性，在應用NGS技術對遺傳性眼病的分析過程中過度依賴基因突變分析技術而忽略患者複雜臨床表型的評估可能在基因測序檢測方法的選擇上出現偏差，造成檢測結果判斷的失誤或給患者帶來經濟負擔。目前，單基因遺傳性眼病基因突變分析方法主要是NGS分析結合Sanger測序驗證，在此過程中應重視患者臨床表型的準確評估，以確保準確選擇基因檢測方法和合理判定致病基因突變。

【關鍵詞】高通量核苷酸測序/應用；分子診斷技術/方法；突變； DNA測序分析/應用；遺傳性眼病; 表型

基金項目：國家自然科學基金項目（81570886）；北京市衛生系統高層次衛生技術人才（學科帶頭人）培養計劃項目（2013-2-021）

單基因遺傳性眼病是一類具有高度遺傳和臨床異質性的致盲眼病，主要包括角膜營養不良、先天性白內障、眼前節發育異常、遺傳性視網膜疾病等。對這類疾病致病基因突變分析的經典方法是首先對遺傳家系致病基因進行連鎖分析染色體定位，然後用一代測序（Sanger測序）對候選基因進行測序分析以確定致病基因突變。在過去的三四十年里，Sanger測序因其測序讀長較長及準確性高等優勢，一直是基因突變分析的主要檢測方法，但其缺點是測序通量小及成本高等，限制了其在具有高度遺傳異質性疾病及大樣本量基因突變分析中的應用。自2005年以來，二代測序（next generation sequencing，NGS）技術應運而生，因其測序通量高、費用較低、速度快及自動化程度高等優點而得到廣泛的應用^[1]。近10年來國內外許多研究團隊用基因定點捕獲技術（targeted exome sequencing，TES）或全外顯子捕獲技術（whole exome sequencing，WES）結合Sanger測序等檢測技術確定了大量遺傳性眼病的致病基因及相應基因的大量致病突變，許多第三方生物公司乃至醫院將致病基因突變分析的研究成果轉化到臨床，紛紛開展了遺傳性眼病患者的基因診斷工作。儘管基因突變分析技術取得了飛躍式發展，但在遺傳性眼病致病基因突變分析研究中及臨床患者基因診斷過程中對患者臨床表型的詳細評估與準確診斷卻不容忽視。

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準確的臨床診斷可正確選擇基因檢測方法或檢測的Panel

儘管許多單基因遺傳性眼病具有遺傳異質性，即不同致病基因可導致相同的臨床表型，如視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）的致病基因多達80餘種，但有些遺傳性眼病的致病基因卻比較單一，如就目前所知，先天性無虹膜的致病基因僅為PAX6，遺傳性視網膜劈裂致病基因為RS1，結晶樣視網膜色素變性（Bietti crystalline corneoretinal dystrophy，BCD）致病基因為CYP4V2，無脈絡膜症致病基因為CHM等^[2-7]。這些致病基因均較小，編碼外顯子均不超過20個，如RS1基因只有6個編碼外顯子，最大的CHM基因也只有15個編碼外顯子，因此對這些疾病患者致病基因突變進行分析時（無論是研究工作還是臨床基因診斷）就沒有必要進行相對複雜的NGS，直接用Sanger測序分析即可準確完成基因診斷，且簡單、快速和方便，應作為首選的方法。在臨床上，部分醫生將先天性無虹膜（特別是部分無虹膜）與虹膜缺損相混淆，這2種疾病均屬於眼前節發育異常，但虹膜缺損患者常伴有脈絡膜缺損，而先天性無虹膜患者則可伴有先天性白內障、繼發性青光眼或黃斑發育不全等，通過眼前節和眼底的詳細檢查即可鑒別。先天性無虹膜患者PAX6基因突變中存在一定比例基因組DNA的拷貝數異常，即1個或數個外顯子，甚至整個基因的丟失或重複，由於該病為常染色體顯性（autosomal dominant，AD）遺傳，Sanger測序不能檢查到此類突變，需要用多重鏈接探針擴增（multiple link probe amplification，MLPA）或實時定量PCR等方法來檢測和分析^[8]。本實驗室前期對42例先天性無虹膜患者進行了PAX6基因直接測序，在31例患者中找到了致病突變，隨後對9例基因檢測結果陰性的患者進行了PAX6基因的MLPA分析，在8例患者中檢測到該基因多個外顯子，甚至整個基因的丟失, 檢出率高達98%（41/42）。BCD患者眼底有特徵性點狀黃白色小結晶，與其他遺傳性視網膜疾病不易混淆^[5]，因此可對這些患者進行CYP4V2基因的直接Sanger測序。本實驗室前期對百餘例BCD患者進行了CYP4V2基因直接測序分析，全部找到了致病突變，檢出率高達100%。

除上述致病基因單一的遺傳性眼病外，具有遺傳異質性眼病患者的臨床表型評估也同樣重要。WES可以檢測基因組DNA所有編碼基因，與致病基因目標區域捕獲技術，即TES相比費用較高，另外就檢測技術來說，捕獲Panel中包括的基因越多，各個基因捕獲覆蓋的一致性就會越低，某些基因序列中高GC含量或重複序列的片段捕獲深度就降低，發生在這些區域的基因突變也易遺漏^[9-11]。 因此，目前在致病基因突變分析研究和臨床患者基因診斷工作中大多數採用TES結合Sanger測序驗證的方法。根據研究目的或疾病類型，目標區域捕獲Panel所包括的基因類型和數目也各不相同，TES Panel的選擇往往取決於患者的臨床診斷。在臨床上，有些疾病臨床表型多樣並且表現度不同，如視錐細胞營養不良患者早期僅表現為視力不好、視盤色淡和黃斑中心凹反光略彌散，如果未詳細詢問病史及進行視網膜電圖（electroretinography，ERG）等檢查，可能會診斷為視神經萎縮，如果用視神經萎縮相關Panel 進行基因突變分析肯定找不到相應的致病基因。本實驗室前期在可疑遺傳性視神經萎縮致病基因突變分析中，後期對197例檢測陰性患者重新進行臨床評估，發現2例患者為錐桿細胞營養不良（cone-rod dystrophy，CRD），並在後續研究中發現這2例患者均攜帶ABCA4致病基因突變。

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準確的臨床診斷有助於致病基因突變的判定

由於大多數單基因遺傳性眼病具有高度的臨床和遺傳異質性，即使用先進的NGS分析（無論是用TES還是WES），患者致病基因突變的檢出率也只有60%~70%，如遺傳性視網膜疾病，主要包括RP、脈絡膜視網膜變性（chorioretinal degeneration，CRD）、Leber先天性黑朦（Leber congenital amaurosis，LCA）等 ^[9-11]。以目前常用的TES為例，通常研究遺傳性視網膜基因的捕獲Panel包括200~300個已知遺傳性視網膜疾病的致病基因 (RetNet，https://sph.uth.edu/Retnet/sum-dis. htm)，每個待測患者樣本通過基因組DNA建庫、目標區域捕獲富集和測序，測序結果進行初步生物信息學分析後，每個樣本大約發現450個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和30個小的缺失或插入，這些數據再經過公共SNP資料庫及自身資料庫等濾過分析，最後每個樣本剩下2~3個基因的5~6可疑致病基因變異^[9-11]。對受檢患者臨床表型進行準確、全面地評估及對其家族史的正確追溯和判斷對確定其致病基因突變十分重要，如果患者有明確的AD家族史，那致病基因突變肯定首選AD的致病基因，如患者父母為近親婚配，則首選常染色體隱性（autosomal recessive, AR）遺傳致病基因的純合突變。但有些情況則比較複雜，某些基因的致病突變既可通過AD遺傳，又可通過AR遺傳的方式進行傳遞，如RP1基因突變既可造成ADRP，又可導致ARRP^[12]。本實驗室前期對1例臨床診斷Usher綜合征的患者進行了基因定點捕獲分析，我們使用的捕獲Panel包括371個遺傳性眼病的致病基因，經過TES分析流程的篩選，選出6個基因的變異為可疑致病突變，均為雜合變異，其中包括3個RP的基因、1個CRD的基因和2個其他非視網膜疾病的致病基因，其中RP1的無義突變p.R1933X似乎是致病突變，在隨後的家系共分離分析中發現其孿生患病弟弟攜帶相同突變，但迄今尚未發現RP1基因突變導致Usher綜合征的報道^[12]，另外患者母親眼底檢查完全正常，也攜帶上述相同無義突變，因此我們又對該患者最初的483個SNP進行分析，找到了1個MYO7A基因的純合錯義突變，家系共分離分析2例患者攜帶相同突變，而患者父母分別攜帶該雜合錯義突變，最終確定這2例患者的致病基因是MYO7A。更為複雜的是還有一些基因的致病突變以AD傳遞時導致的臨床表型與以AR傳遞時引起的臨床表型不同，如GUCY2D基因的雜合錯義突變導致CRD的臨床表型，而純合或複合雜合突變（主要是無義或小缺失或插入突變）則導致嚴重的LCA；PDE6B基因的雜合致病突變導致AD先天性靜止性夜盲，而複合雜合或純合突變則導致ARRP^[13]。對可能攜帶這些基因突變患者更需要仔細進行臨床表型評估及準確地判定遺傳方式。另外，還有少數患者通過NGS 分析後僅找到AR致病基因的雜合突變，在這種情況下，準確的臨床診斷對判斷該基因是否為致病基因也很重要，關係到下一步基因分析方法的選擇。例如，1例臨床上診斷RP的患者經TES分析發現1個BBS2基因的無義雜合突變，BBS2基因突變導致Bardet-Biedl 綜合征（Bardet- Biedl syndrome，BBS），患者除有RP的臨床表型外，還可伴有腎病、肥胖、多指（趾）、發育遲緩等表型^[13]。與其他遺傳性視網膜病變相似，BBS患者的臨床表型差別很大，一些患者除了RP和多指（趾）的臨床表型外，沒有上述其他的臨床表型，而許多患者在出生後不久就已手術切除多指（趾），有些患者甚至不知道有該臨床表型，因此在這種情況下要對患者的臨床表型再次評估，如臨床上診斷為BBS，就可初步推測BBS2是該患者的致病基因，另外1個突變等位基因可能是大片段缺失或重複等基因組DNA 拷貝數異常，或者NGS過程中對該基因某些區域覆蓋捕獲不好造成遺漏，需用Sanger測序進行補充測序查找。理論上NGS可以檢測到拷貝數異常，但是由於其檢出的敏感性與NGS的捕獲深度和拷貝數異常的大小等因素有關，對可疑攜帶拷貝數異常的患者樣本往往還需要用MLPA等其他方法進行分析。

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小結

總之，隨著分子遺傳學技術，特別是NGS技術的發展，發現了越來越多的遺傳性眼病的致病基因和致病基因突變，越來越多的患者也得到了相應的基因診斷。相關的研究人員和臨床工作者在遺傳性眼病致病基因突變分析研究或患者基因診斷過程中應重視臨床表型的準確評估，因為其在很大程度上關係到檢測方法的選擇和致病基因突變的最後判定。

參考文獻：略

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