手把手教你SCI必備實驗熒光素酶報告基因引物設計

熒光素酶報告基因實驗

該實驗是通過將預測能夠與miRNA結合的靶基因3』UTR序列插入載體中螢火蟲熒光蛋白的3』UTR通過監測熒光素酶的活性變化，即可獲得miRNA是否對靶基因3 -UTR產生調控作用。

當我們研究的miRNA和質粒中的插入的3』UTR序列結合後，miRNA會通過和插入的3』UTR序列結合從而抑制螢火蟲熒光蛋白的翻譯最終造成熒光值的下降。反之，當miRNA與報告基因（包含靶標區域突變）無法形成有效的互補配對時，熒光素酶活力將與對照無顯著區別。

今天小編就來講解一下如何設計野生型熒光報告引物。以mmu-miR-21與靶基因GPR64為例。

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靶基因序列的預測

首先，進入Targetscan網站預測mmu-miR-21a-5p的靶基因。

以mmu-miR-21a-5p的第一個靶基因GPR64為例，點擊sites in UTR。

mmu-miR-21a-5p可以結合靶基因GPR64的3』UTR,並且獲得的結合位點序列。

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UCSC網站查詢靶基因的3』UTR全長

進入UCSC網站，輸入基因名稱。

GPR64別名為Adgrg2，點擊圖中藍色加深基因名稱。

點擊Genimic Sequence進入，獲得基因序列。

如圖所示，設定查詢基因5』UTR，外顯子以及3』UTR序列。其中5』UTR與3』UTR為字母小寫，CDS區字母大寫。

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設計引物

根據獲得的3』UTR種查找到mmu-miR-21a-5p的結合位點，如圖黃色區域（注該基因有兩處結合位點，以第二處為例）。這裡要注意，不一定要插入靶基因的3』UTR全長。可以只插入包括miRNA結合位點前後200bp左右的序列，如選用紅色序列作為擴增區域引物。

紅色引物序列選擇前可以在NCBI進行blast基因特異性。

根據實驗需求，選擇熒光素酶報告載體，如psiCHECK-2。確定酶切位點，如XhoI和NotI。根據限制性內切酶的識別位點，在引物兩端加上相應識別位點序列以及相應的保護鹼基。

XhoI識別位點

NotI識別位點

即可獲得最終設計引物：

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