「葯輔合一」茶多酚-蜂毒肽納米複合物的製備及抗腫瘤研究

腫瘤是世界上最難治癒的疾病之一。近幾年，我國每年有400萬左右的新發腫瘤病例和300萬左右的癌症死亡病例[1]，腫瘤已經嚴重威脅到了人類健康，實現癌症的高效治療，提高患者的治癒率和生存率仍然是癌症研究領域的熱點問題。在目前癌症的治療中，化療佔據至關重要的地位，然而化療產生的毒副作用以及多次給葯後出現的多葯耐藥性（MDR），往往使腫瘤的臨床治療效果欠佳[2-4]。近年來，很多研究報道了中藥在腫瘤治療中的獨特優勢[5]，如降低毒副作用、逆轉多葯耐葯[6-7]等，在腫瘤治療的傳統經方中多用動物葯，如全蠍、蜂毒、烏蛇、蜈蚣等，這些動物葯具有鑽透剔邪、搜風通絡的功效，現代藥理實驗證實了這些動物葯的抗腫瘤活性成分多為多肽，從中藥多肽中篩選出具有抗腫瘤活性的成分，同時能逆轉腫瘤的MDR，是研發抗腫瘤藥物的熱點方向之一。然而，這些中藥毒肽具有較強的毒性[8]，其抗原性可能會導致過敏反應。此外，多肽類藥物在體內穩定性較差，易被酶降解，在某些生理環境下常發生聚集沉澱[9-10]。因此，開發適宜的遞葯系統以增加中藥多肽藥物在體內的穩定性，延長體內半衰期，同時提高藥物腫瘤分布的選擇性，減小毒副作用，是解決目前腫瘤治療困境的重要途徑之一。本研究以具有抗腫瘤作用的蜂毒肽（melittin，Mel）為模型藥物，構建茶多酚-蜂毒肽納米複合物（EMN），以期發揮減毒增效的治療效果，為開發中藥毒肽類藥物的臨床價值提供思路和方法。

Mel是蜂毒的主要有效成分，是由26個氨基酸組成的陽離子多肽[11]，其氨基酸序列為NH2-Gly- Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-

Gln-COOH，相對分子質量（Mr）2 840，靠近N端的前20個氨基酸是疏水性的，靠近C端的後6個氨基酸是親水性的，因此具有兩親性[12]。Mel易溶於甲醇，極易溶於水（＞250mg/mL），在中性水溶液中，低濃度的Mel以單體的形式存在，主要構象為無規則捲曲，隨著pH值和濃度的提高，Mel會自我交聯，形成α-螺旋的四聚體結構[13]。Mel具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病等多種藥理活性[14]。Mel被報道與某些化療葯合用具有協同抗腫瘤的效應，能有效地治療已經產生多葯耐葯的癌症。Wang等[15]研究報道了Mel能夠增加HCC細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）的敏感性，證實了TRAIL與Mel的合用可以有效治療對TRAIL耐葯的人類癌症。王瑞平等[16]報道了Mel與5-氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑（DDP）和多西他賽（TXT）合用對人胃癌細胞的協同作用。然而，Mel因其具有溶血毒性強、分布特異性差、易代謝降解等缺點，極大地限制了其在臨床中的應用。

茶多酚是茶葉的主要活性成分，其中量最多的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3- gallate，EGCG）。EGCG具有多重藥理活性，可通過上調抑癌基因p53的表達，抑制PI3k/Akt通路的活化，誘導腫瘤細胞凋亡[17]。EGCG還可通過抑制促腫瘤血管生長因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）的活性，減少腫瘤外周血管和纖維成分，改善納米粒的遷移能力[18-20]。研究表明，EGCG具有很強的蛋白親和力。如酪蛋白與EGCG結合可提高EGCG的穩定性，控制EGCG的緩慢釋放[21]。本課題組前期的研究也證實，兒茶酚殘基可以通過氫鍵、疏水作用以及配位鍵等非共價作用與多種化合物或生物表面結合形成穩定的超分子[22]。多酚成分在自然狀態下可自發轉變為聚合態形式，其穩定性優於單體，且易被水解酶降解而不會對正常組織產生毒性[23]。這提示可以使用多聚EGCG（polyEGCG）作為葯源性載體負載Mel。本課題組前期對葯源性功能載體的製備和開發進行了一些研究，證明這類載體不僅可以解決「無效」載體的安全性問題，而且其自身功能也可助力其他活性物質增效減毒[24]，這符合中藥製劑「葯輔合一」的傳統理念[25]。因此，本實驗將藥性溫和、安全、可生物降解的polyEGCG作為載體，與Mel進行組裝，完成「葯輔合一」體系的構建。因溶血活性端的可逆性絡合，降低了Mel的毒副作用[19]，同時減少了「無效」載體的使用，解決了藥物及載體二者潛在的安全性問題。

1儀器與材料

BT25S型十萬分之一天平，德國Sartorius公司；DF-10SA-H磁力攪拌器，南京科爾儀器設備有限公司；Nano ZS90激光粒度儀，英國Malvern公司；H7650透射電鏡，日本Hitachi公司；2998型高效液相色譜系統，美國Waters公司；MCO-15AC細胞培養箱，日本Sanyo公司；C6流式細胞儀，美國BD公司；ELX800酶標儀，美國BioTek公司。

EGCG，批號645700241，質量分數＞98%，大連美崙生物技術有限公司；40%乙醛、二甲基亞碸（DMSO），分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；冰醋酸，分析純，南京化學試劑有限公司；透析袋，截留Mr為1 000，上海綠鳥科技發展有限公司；高純氮，純度大於99.999%，江蘇天宏有限公司；氘代二甲基亞碸（質量分數＞99.9%）、三氟乙酸（質量分數＞99.5%）、異硫氰酸熒光素（FITC，質量分數＞90%），阿拉丁試劑有限公司；Mel，批號201505001，質量分數＞98%，上海吉爾生化有限公司；噻唑藍（MTT），質量分數＞98%，南京生興生物有限公司；DMEM培養基、PBS、0.25%胰酶、雙抗（10 000 IU盤尼西林，10.000 mg/mL鏈黴素）均為HyClone產品，胎牛血清為Gibco產品。

小鼠黑色素瘤B16F10細胞株和人肺腺癌A549細胞株，均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2方法與結果

2.1polyEGCG的合成與表徵

polyEGCG的合成反應見圖1，稱取1.0 g EGCG溶解於15 mL乙酸、45 mL水和6 mL DMSO的混合溶液中，加入7.2 mL 40%乙醛，調節pH值至2，在20℃氮氣保護下反應12 h，產物用截留Mr1 000的透析袋透析，凍干，產率為93.25%。產物經1H-NMR和MS進行結構確證。

產物的1H-NMR圖譜見圖2，結果表明EGCG的A環上的6位和8位質子峰（δ5.8左右）消失，EGCG單體沒有甲基氫，而polyEGCG的1H-NMR圖譜上在δ1.3～1.8位置產生甲基和亞甲基質子峰，證明了CH3-CH橋連在EGCG的A環6位或8位上，形成polyEGCG聚合物，其具體連接方式可能為C6-C6、C6-C8或C8-C8位連接。polyEGCG的MS結果表明最高聚合態為EGCG六聚物，Mr為2 906，證實了EGCG聚合反應的發生。

2.2polyEGCG與Mel的複合工藝篩選

Mel是一種兩親性的多肽，其粒徑用粒徑儀未檢測出，利用正交設計實驗優化Mel與polyEGCG複合的條件，以EMN的平均粒徑為考察指標，考察Mel與polyEGCG複合比例（質量比，A）、pH值（B）和複合溫度（C）對EMN平均粒徑的影響。稱取Mel和polyEGCG溶於pH值4.5、6.5、7.4的緩衝體系中，在質量濃度為1.0mg/mL的Mel溶液中逐滴加入等體積不同質量濃度的polyEGCG（0.1、0.5、1.0 mg/mL）溶液，在25、37、60℃的溫度下孵育30 min，馬爾文激光粒度儀測定EMN的平均粒徑和多分散係數（PDI），用軟體正交設計助手（IIV3.1）對結果進行分析。結果見表1、2。由表1可知，以平均粒徑為EMN製備工藝評價指標，3個因素對製備工藝的影響順序為Mel與polyEGCG複合比例＞複合溫度＞pH值。

由表2中正交試驗方差分析結果可知，Mel與polyEGCG複合比例和複合溫度對EMN粒徑具有顯著影響（P＜0.05），而體系的pH值對EMN平均粒徑幾乎沒有影響。

由圖3可知，Mel質量濃度保持不變時（1.0 mg/mL），隨著加入polyEGCG的量增加，EMN的平均粒徑先保持不變而後增加，過量的polyEGCG可能會導致EMN的聚集。在25℃和37℃孵育溫度下，EMN的平均粒徑幾乎不變，當溫度升高至60℃時，平均粒徑顯著增大。在3種pH值條件下複合，平均粒徑沒有顯著性變化。基於上述結果，EMN的製備工藝擬定為在1.0mg/mL Mel水溶液中逐滴加入等體積0.5mg/mL polyEGCG水溶液，邊滴加邊攪拌，室溫孵育30 min。

按上述工藝製備的EMN粒徑分布和透射電子顯微鏡（TEM）圖見圖4和圖5，在該比例下，EMN為類球形，平均粒徑為（127.67±5.17）nm，PDI為0.24±0.04，表面電荷為（25.4±1.8）mV，所製備的EMN粒徑較優，粒徑分布均一。

2.3體外釋放實驗研究

2.3.1色譜條件色譜柱為漢邦C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%三氟乙酸水（44.5∶55.5）；體積流量為1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長220 nm；進樣量20 μL；理論塔板數以Mel計不低於3 000。

2.3.2線性關係考察精密稱取12.59 mg Mel置於量瓶中，加水定容到10 mL，精密取1 mL於10 mL量瓶中，將Mel稀釋到125 μg/mL作為母液，分別移取0.02、0.04、0.08、0.20、0.40、1.00 mL母液於10 mL量瓶中，加水定容，配得0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、12.50 μg/mL對照品溶液，液相進樣測定。將峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸曲線Y＝406 337X＋81 486，r＝0.999 7，結果表明Mel在0.25～12.50 μg/mL線性關係良好。

2.3.3EMN的體外釋放實驗取2 mL EMN溶液裝入截留Mr25 000透析袋中，浸沒於18 mL pH 4.5、6.5、7.4的緩衝液中，放入（37.0±0.5）℃的氣浴搖床中，搖床轉速為600 r/min。分別於0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取0.2 mL釋放介質，同時補充0.2mL新鮮介質。樣品進液相測定Mel量，平行3份。結果見圖6，在pH 7.4的緩衝體系中，EMN釋放緩慢，24 h的累積釋放量不足10%，EMN可在中性生理環境下保持穩定；在pH 6.5條件下，24 h的累積釋放量為（23.40±2.87）%，比中性環境下略有增加；而在pH4.5的環境下，EMN的釋放明顯加快，24 h的累積釋放量增加至（49.27±5.36）%，說明酸性環境能加速Mel的釋放。

2.4細胞攝取實驗

取對數生長期的小鼠黑色素瘤細胞B16F10細胞，以每孔1 mL 1×105的細胞密度接種於12孔細胞培養板，細胞培養箱中培養24 h，待細胞貼壁生長後，小心移去細胞培養基，加入1 mL含FITC標記的Mel、EMN的培養基（FITC標記的Mel終質量濃度均為5 μg/mL），37℃孵育1、2、4、6 h，或加入含FITC標記的Mel終質量濃度為1.0、2.5、5.0、7.5 μg/mL的Mel、EMN的培養基，37℃孵育4 h。棄去藥物，加1 mL預冷的PBS洗2次，加胰酶0.4 mL消化，加1 mL完全培養基終止消化，將細胞收集到2 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養基，加0.5 mL預冷的PBS重懸細胞，用尼龍膜濾過，流式細胞儀測定。結果見表3、4，B16F10細胞對Mel和EMN的細胞攝取量均隨著質

量濃度和時間的增加而增加，呈現質量濃度和時間的依賴性，EMN的細胞攝取量與遊離Mel的細胞攝取量相當。

2.5細胞毒性實驗

為了考察EMN對腫瘤細胞的抑制作用，本實驗選擇了2種不同來源的腫瘤細胞：小鼠黑色素瘤B16F10細胞和人肺腺癌A549細胞。以1×104/孔的細胞密度接種在96孔板上，在37 ℃孵育12 h，移去培養基，加入含不同質量濃度Mel、polyEGCG和EMN的不完全培養基200 μL（EMN中polyEGCG與Mel質量比為1∶2，Mel質量濃度為0.05、0.10、1.00、5.00、10.00、25.00 μg/mL，polyEGCG質量濃度為0.025、0.050、0.500、2.500、5.000、12.500 μg/mL），37℃培養24 h，移去培養基，加200 μL PBS清洗1次，加含MTT的不完全培養基200 μL，37℃孵育4 h，移去溶液，加150 μL DMSO，搖床搖勻，酶標儀570 nm測定吸光度（A）值。結果見圖7，EMN對B16F10和A549 2種細胞均有明顯的抑制作用。EMN對2種細胞的半數致死質量濃度分別為Mel 1.950 μg/mL、polyEGCG 0.975 μg/mL（B16F10）和Mel 2.981 μg/mL、polyEGCG 1.490 μg/mL（A549），均小於Mel的3.785 μg/mL（B16F10）、6.808 μg/mL（A549）和polyEGCG的42.432 μg/mL（B16F10）、29.922 μg/mL（A549），表現出更優的抗腫瘤增殖活性。

通過協同係數（CI）[26]評價Mel和polyEGCG的聯合治療效果，CI＝D1/Dx1＋D2/Dx2，其中D1和D2分別是聯合使用時達到Fa抑制率時Mel和polyEGCG的質量濃度，Dx1和Dx2分別是Mel和polyEGCG單獨使用達到Fa抑制率時的質量濃度。當CI＝1.0時，表示加合效應；CI＜1.0，代表協同作用；CI＞1.0，則是拮抗作用[27]。

用SPSS軟體擬合Mel、polyEGCG和EMN對B16F10和A549細胞達到不同Fa抑制率時的藥物質量濃度，使用公式計算Fa抑制率對應的協同係數CI值，Fa抑制率在CI值0.2～0.8可用於評價藥物的協同效應[28]，由圖8可知，當Fa在0.2～0.8時，對應的CI值均小於1.0，證明Mel與polyEGCG合用發揮協同抗腫瘤作用。

3討論

中藥毒肽具有明確的抗腫瘤效果，然而其對細胞毒性的選擇性差，直接使用常會帶來嚴重的毒副作用；中藥毒肽屬於外源性生物製品，具有一定的免疫原性，易導致過敏反應；多肽類藥物在體內穩定性較差，易被酶降解，在某些生理環境下可發生聚集沉澱而失效；多肽藥物在血液中半衰期較短，iv後短時間內就被清除或降解，為了達到藥效劑量，常需要頻繁給葯，給病人帶來諸多的不便。為了解決毒肽藥物的上述成藥性問題，開發安全、高效的遞葯系統，本課題選用Mel作為模型藥物，並利用polyEGCG的多肽識別作用，複合製備了EMN。正交試驗考察了複合比例、pH值和複合溫度對EMN平均粒徑的影響，優化了工藝條件。製備的EMN為類球形，分布均一。體外釋放實驗表明EMN在中性生理環境下，Mel釋放量較少（＜10%），而在酸性環境下（如腫瘤微環境或溶酶體環境），Mel加速釋放。這有利於提高Mel的安全性和腫瘤區域的定位釋放效果。體外細胞毒性實驗研究了Mel與polyEGCG合用的抗腫瘤效果，證明EMN對多種腫瘤均有明顯的抑制作用，二葯聯用可發揮協同效應。上述結果表明，本課題構建的「葯輔合一」EMN，充分利用了二者結構和功能的互補性，既減少了無效載體的應用，又實現了聯合用藥協同增效的目的，對中藥毒肽類活性成分新製劑的開發和臨床應用具有較好的借鑒意義。

參考文獻（略）

來 源：方 棟，張 蕾，孫 娟，吳文瀚，喬宏志，狄留慶. 「葯輔合一」茶多酚-蜂毒肽納米複合物的製備及抗腫瘤研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(16):3300-3307.

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