化學發光免疫技術

化學發光免疫技術

第一節概述

第二節化學發光劑和標記技術

第三節化學發光免疫分析的類型

第一節概述

發光免疫分析是將發光分析和免疫反應相結合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術。這種方法兼有發光分析的高靈敏性和抗原抗體反應的高特異性。發光是指分子或原子中的電子吸收能量後，由基態（較低能級）躍遷到激發態（較高能級），然後再返回到基態，並釋放光子的過程。

光照發光、生物發光、化學發光

一、化學發光

化學發光是指伴隨化學反應過程所產生的光的發射現象。熒光是吸收了光能使分子激發而發射的光。化學發光是吸收了化學能使分子激發而發射的光。

二、化學發光效率

化學發光反應的發光效率就是化學發光反應量子產率。

第二節化學發光劑和標記技術

一、化學發光劑

在化學發光反應中參與能量轉移並最終以發射光子的形式釋放能量的化合物。

（一）直接化學發光劑

在發光免疫分析過程中不需酶的催化作用。

1.吖啶酯在鹼性條件下被H2O2氧化時，發出波長為470nm的光，具有很高的發光效率，其激發態產物N一甲基吖啶酮是該發光反應體系的發光體。吖啶酯類發光劑可直接用於標記半抗原和蛋白質等。用於標記抗體時，結合穩定，結合後並不減少光量子的產生，可獲得高的比活性，有利於雙位點化學發光免疫分析的建立。

2.三聯吡啶釕三聯吡啶釕是電化學發光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發生氧化反應。

（二）酶促反應發光劑

利用標記酶的催化作用，使發光劑（底物）發光。目前化學發光酶免疫分析中常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶。辣根過氧化物酶催化的發光劑為魯米諾及其衍生物。鹼性磷酸酶催化的發光底物為AMPPD。

1.魯米諾及其衍生物魯米諾、異魯米諾及其衍生物都有化學發光特性。魯米諾是最早合成的發光物質。

2.AMPPD是一種新的化學發光劑，其分子結構中有兩個重要部分，一個是連接苯環和金剛烷的二氧四節環，它可以斷裂並發射光子；另一個是磷酸基團，它維持著整個分子結構的穩定。

二、發光劑的標記技術

發光劑的標記是通過化學反應將發光劑連接到抗體或抗原上。標記反應分為「直接偶聯」和「間接偶聯」兩種方式。

（一）常用標記方法

1.碳二亞胺縮合法

2.過碘酸鈉氧化法

3.重氮鹽偶聯法

4.N-羥基琥珀醯亞胺活化法

（二）影響標記的因素

1.發光劑的選擇

2.被標記蛋白質的性質

3.標記方法的選擇

4.原料比

5.標記率

6.溫度

7.純化與保存

第三節化學發光免疫分析的類型

一、直接化學發光免疫分析

直接化學發光免疫分析是用化學發光劑（如吖啶酯）直接標記抗體（抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發生免疫反應後，形成固相包被抗體一待測抗原一吖啶酯標記抗體複合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和pH糾正液（NaOH）使呈鹼性環境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發光，由集光器和光電倍增管接收，記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。

吖啶酯化學發光的特點：推動者發光的氧化反應簡單快速，不需要催化劑，只要在鹼性環境中即可進行；反應體系中加入H2O2和NaOH溶液後，發光迅速，背景雜訊低，保證了測定的敏感性；吖啶酯可直接標記抗原或抗體，結合穩定，不影響標誌物的生物學活性和理化特性；吖啶酯發光為瞬間發光，持續時間短，因此，對信號檢測儀的靈敏度要求比較高。

二、化學發光酶免疫分析

化學發光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學發光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或鹼性磷酸酶（ALP）來標記抗體（或抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發生免疫反應後，形成固相包被抗體一待測抗原一酶標記抗體複合物，經洗滌後，加入底物（發光劑），酶催化和分解底物發光。由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號並加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。

三、電化學發光免疫分析

電化學發光免疫分析（ECLIA）與一般化學發光分析不同，是以電化學發光劑三聯吡啶釕標記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉移而發生特異性化學發光反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。在電化學發光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體（抗原），用三聯吡啶釕標記抗體（抗原），在反應體系內待測標本與相應的抗體發生免疫反應，形成磁性微粒包被抗體一待測抗原一三聯吡啶釕標記抗體複合物，這時將上述複合物吸人流動室，同時引入TPA緩衝液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩衝液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發光反應，使三聯吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光。光信號由安裝在流動室上方的光信號檢測器檢測，光的強度與待測抗原的濃度成正比。

四、臨床應用

由於化學發光免疫測定技術無放射性污染，同時能達到放射免疫測定的靈敏度，而且還具有快速、準確、特異、可自動化等特點，因此已廣泛應用於各種激素、腫瘤標誌物、藥物濃度及其他微量生物活性物質的測定。

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