抗腫瘤四氫異喹啉生物鹼生物合成途徑中新機制的發現

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對結構獨特、活性顯著的複雜天然產物進行生物合成研究需要從基因、途徑及酶催化反應的角度理解自然界生物-化學合成、調控及拮抗的過程，屬於典型的有機化學-微生物學-生物化學-天然產物藥學的交叉學科，對於天然產物藥物研究中重點關注新結構的發現、創造和複雜化合物的高效製備均具有重要的推動作用。

自1974年萘啶黴素（Naphthyridinomycin，NDM）首次分離，四氫異喹啉生物鹼類（Tetrahydroisoquinline, THIQ）天然產物已有四十餘年的研究歷史。該家族化合物共包括60多種分子，大多具有顯著的抗菌及抗腫瘤活性。代表性化合物除NDM外還包括假單胞菌產生的番紅菌素（Safracin）、鏈黴菌產生的番紅霉素A（Saframycin A, SFM-A）及加勒比海鞘分離到的Ecteinascidin 743（ET-743）。特別是ET-743作為第一例海洋天然產物來源的抗腫瘤新葯於2007年在歐洲獲批，隨後於2015年獲得美國FDA批准上市。該家族化合物在有機合成和藥物化學領域一直備受青睞，其生物合成途徑和涉及的詳細酶學機制也引起化學家和生物學家的廣泛關注。

中國科學院上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室的唐功利研究團隊多年來一直致力於該家族化合物的生物合成與合成生物學研究。最近該團隊成功解密SFM-A生物合成過程最後的修飾步驟，該過程涉及兩個關鍵蛋白SfmE和SfmCy2，它們分別參與SFM-A生物合成中後期獨特的前葯激活（Prodrug-activation）及胞外脫氨（Extracellular deamination）修飾過程。

2008年，唐功利與劉文課題組合作首先克隆了SFM-A的生物合成基因簇，初步提出其生物合成途徑。在隨後的研究中課題組成員唐滿成博士發現並證實了蛋白SfmD以過氧化氫為氧化劑催化3-甲基酪氨酸芳香環發生羥基化。而日本的Hideaki Oikawa課題組通過體外生化實驗重構SFM-A的THIQ核心骨架結構，並發現SfmC催化兩次連續的Pictet-Spengler反應形成分子骨架，該過程中長鏈脂肪酸起到了非常關鍵的導向作用。在最新的研究中，通過前期工作的積累以及對SFM-A基因簇的進一步分析，唐功利研究團隊提出以下假設：SfmC在細胞體內催化生成SFM-A的分子骨架化合物，然而其攜帶的脂肪酸長鏈保護細胞內的DNA不受到傷害；隨後跨膜蛋白SfmE將中間產物中的長鏈保護基解離，同時小分子被泵出胞外，實現前葯激活並裸露一個氨基，隨後分泌型氧化酶SfmCy2催化一步脫氨反應，將該氨基消除並形成最終產物SFM-A（化合物1）。

圖1. 推測的SFM-A生物合成途徑

基於以上假設，該團隊設計了相關實驗，將SfmCy2在S. lividans1326中異源表達，結果顯示SfmCy2能分泌到胞外；隨後他們對胞外分泌蛋白富集後進行端基測序，測序結果表明SfmCy2與生物信息學分析的結論一致：胞外分泌蛋白缺失N-端信號肽序列，屬於雙精氨酸轉運（Twin-arginine translocation, Tat）蛋白同源的分泌蛋白，在胞外行使催化功能。同時，他們在氰化鉀處理後SfmE的缺失突變體發酵液中檢測到氰基化的長鏈脂肪醯中間體（圖1，化合物7），隨後的全細胞轉化和膜蛋白組分生化實驗進一步表明蛋白SfmE解離了中間體的長鏈脂肪酸，生成化合物3，發生前葯激活。他們同樣通過SfmCy2的體內敲除及體外酶催化實驗，進一步證明其胞外脫氨修飾的酶學功能，並發現最終生成的羰基官能團中氧來源於H2O。

該工作揭示了SFM-A生物合成中的前葯活化機制及獨特的胞外脫氨修飾機制，不僅補充了SFM-A生源合成路徑的最後一環，也是整個THIQ家族生物合成研究中的重要一步，為進一步在分子水平上調控THIQ家族化合物的組合生物合成及合成生物學研究奠定了理論基礎。

這一成果近期發表在Angewandte Chemie International Edition上，宋立強博士、研究生章盈盈和蒲津越博士為並列第一作者。

該論文作者為：Dr. Li-Qiang Song, Ying-Ying Zhang, Dr. Jin-Yue Pu, Dr. Man-Cheng Tang, Dr. Chao Peng, Prof. Dr. Gong-Li Tang

Catalysis of Extracellular Deamination by a FAD-Linked Oxidoreductase after Prodrug Maturation in the Biosynthesis of Saframycin A.

Angew. Chem. Int. Ed.,2017,56, 9116-9120, DOI: 10.1002/anie.201704726

唐功利

http://www.x-mol.com/university/faculty/15570

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