「淺嘗」全轉錄組研究套路！

最近越來越多的科研君緊跟「步伐」，「玩轉」起了全轉錄組（全轉錄組即包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA的測序）。全轉錄組之所以這麼火的原因就在於大家逐漸意識到單一的mRNA或ncRNA研究已無法滿足科研需求，需要結合多種RNA信息進行整合分析，探索潛在的調控網路機制。而全轉錄組測序無疑成為闡釋生物學問題的利器！

但是目前存在的一個問題可能很多老師對全轉錄數據如何進行深度挖掘還是很清楚，那今天小編就帶您通過一篇文章來體驗一下全轉錄組的研究套路吧！

研究背景

哺乳動物雄性種系幹細胞也稱為精原幹細胞（SSC），可以體外培養SSCs的系統。雌性種系幹細胞（FGSCs）可以使用小鼠血漿同系物（MVH）為基礎進行純化和分離。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉錄本長度>200nt的功能分子，能夠在轉錄及轉錄後水平上調節蛋白編碼基因的表達, 從而廣泛地參與包括細胞分化、個體發育在內的重要生命過程。環狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，circRNA分子呈封閉環狀結構，研究表明，circRNA分子富含miRNA結合位點，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用。

中文名：系統鑒定和解析小鼠胚胎幹細胞中lncRNAs 和 circRNAs共表達模式及ceRNA網路

英文名：Systematic identification and comparison of expressed profiles of lncRNAs and circRNAs with associated co-expression and ceRNA networks in mouse germline stem cells.

雜 志：Oncotarget, 2017.

影響因子：IF=5.168

1.實驗材料：

小鼠雄性精原幹細胞（SSC）和雌性卵母幹細胞（FGSCs），每種樣本3個生物學重複

2.測序平台

Illumina Hiseq 2000 platform，6個樣本

3.技術路線：

圖1 技術路線

研究結果

1、lncRNAs鑒定

將數據與lncRNA資料庫進行比對，篩選已知lncRNA。lncRNA資料庫包括RefSeq（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq /），Ensem（http://asia.ensembl.org/index.html），或 Noncode v3.0（http://www.noncode.org/index.php）。採用CPC和CNCI軟體，鑒定了18573新的lncRNAs和5803已知lncRNA。隨機選擇新預測的lncRNA使用RT-PCR進行驗證。如圖2C所示，新的lncRNA轉錄物全部被擴增出預期大小，證明其真實存在。qRT-PCR結果表明所選擇的lncRNA的表達模式在兩組細胞系中的表達量與測序得到的FPKM值相符（圖2D）

圖2.A.已知lncRNA和新預測的lncRNA數目統計圖；B.lncRNA長度分布圖；C.RT-P

2、新預測的lncRNAs在染色體的位置和分類以及表達譜

統計發現lncRNA和mRNA轉錄物分布在所有小鼠染色體上（圖3.A）。另外，根據其在染色體上的位置，可以對lncRNA進行分類：sense overlap lncRNA, bidirectional lncRNA, antisense lncRNA和intergenic lncRNA（圖4.B） 。在本研究中發現新預測的lncRNAs主要位於基因間區。同時每種類型的lncRNA的數量，在SSC和FGSC之間的數目是相似的。

圖3.A.mRNA和lncRNA在染色體上分布圖；B.lncRNA分類統計圖

3、小鼠SSCs和FGSC的lncRNA表達譜和GDNF信號機制

表達量熱圖表明某些基因在SSC和FGSCs中的mRNA和lncRNA水平具有相似的表達模式（圖4A，4B）。同時，在雄性和雌性種系幹細胞中有8115 mRNA和3996個lncRNA（包括3695個新預測的lncRNA）表現性別特異性表達（p值

另外，功能分析顯示高度共表達的mRNA和lncRNAs的 GO功能富集與細胞周期、細胞增殖和細胞分裂有關，意味著SSCs和FGSCs具有類似的生殖幹細胞維持機制，符合以前研究的結果。GDNF（膠質細胞源性神經營養因子）可以通過by PI3K-Akt, Ras/ERK1/2 和SFK 途徑實現自我修復。在SSCs和FGSCs高度共表達的mRNA和lncRNAs顯著性富集於PI3K-Akt通路，說明SSCs和FGSCs具有類似的GDNF信號傳導機制。

圖4.A/B.lncRNAs/mRNA表達量熱圖

圖5.A/B性別特異性表達的lncRNAs/mRNA表達量熱圖

4、性別特異性表達的lncRNA-靶基因功能分析

對性別特異性表達的lncRNA-靶基因進行GO和KEGG分析。在GO分析中（圖6A），lncRNA的預測功能主要是與行為，生物粘附，生物鐘和生物調節有關。性別偏向表達的mRNA和lncRNA在GO功能主要涉及在遺傳印記及其相關調控。KEGG通路分析表明總共有3996個性別特異性的表達的lncRNA 注釋到204個KEGG途徑（圖6B）。這些KEGG通路主要涉及糖代謝，蛋白質代謝和脂質代謝途徑，說明其在細胞分化過程中的重要位置，以及lncRNA可能通過這些信號通路。同時顯著性富集的還有跟激素相關的代謝途徑，特別是性激素在SSCs和FGSCs之間是完全不同的。

圖6.A.前10個GO功能注釋結果圖；B前10個KEGG途徑結果圖

5、性別偏向表達的lncRNAs和mRNA共表達分析和功能預測

選擇10個在SSCs和FGSCs中顯著性偏向表達的lncRNA和mRNA進行基因共表達網路（CNC網路）。這些mRNA涉及數個生物過程，包括生殖、幹細胞分化、生殖過程、性別分化、遺傳印記和性染色質形成等生物學過程。共表達網路顯示上調的lncRNAGm11851與遺傳印記相關的基因Eed、Ndn和Peg3呈負相關，而下調lncRNA Gm12840與之呈正相關。上調的lncRNA 4930405O22Rik是與遺傳印記的調控相關的基因Zfp42，Dppa3和Rnf2呈正相關，下調的lncRNA Atp10d與之呈負相關。

圖7.lncRNAs和mRNA共表達網路圖

6、circRNA的鑒定和功能分析

採用CIRI軟體共鑒定到18822個circRNA，大部分的鑒定的circRNA是外顯子circRNA，只有345個circRNA是來源於內含子。我們發現9812（52.13％）circRNAs來源於線性RNA的正義鏈和9010（47.87％）circRNA來自於線性RNA的反義鏈。有研究表明，大多數circRNAs的形成都是由位於線性RNA的中間外顯子剪切形成，在本研究中獲得了類似的結果（圖8A）。隨機挑選幾個cirRNA，通過RT-PCR驗證了它們的真實存在（圖8B）。作者進一步比較了circRNA來源基因的表達量與其他未能剪切形成circRNA的線性RNA的表達量，結果表明前者的表達量要顯著高於後者（圖8C）。對circRNAs來源基因進行GO和KEGG分析發現，這些基因主要參與幹細胞的自我更新和分化過程。circRNA表達譜顯示921個circRNA表現出性別特異性的表達（圖8D）。對這921個性別特異性表達的circRNAs來源基因分開進行GO和KEGG分析發現這些基因參與生殖細胞的分化過程。選擇前10個GO功能以及KEGG途徑進行作圖（圖8E和圖8F），前10個GO功能注釋包括調節細胞分化，信號轉導和長鏈脂肪酸生物合成等，前10個KEGG途徑包括PPAR信號通路、胰島素信號通路、VEGF信號通路、GnRH信號通路等。

圖8.A.circRNA成環位點分布圖；B.RT-PCR驗證結果；C.表達量箱線圖；D.性別特異性表

7、ceRNA網路構建

通過mRNA、lncRNAs、circRNAs和miRNA s（資料庫數據）的表達模式及調控關係構建ceRNA網路。miRNA結合位點預測通過 miRcode資料庫 (http://www.mircode.org/)，同時miRNA–mRNA 靶標關係通過 TargetScan (http://www.targetscan.org/)預測得到。性別特異表達的60個lncRNA和29個circRNA，可以競爭性地結合相同的MRE（miRNA反應元件）。例如，lncRNA Meg3和cirRNA Igf1r可以競爭性地結合miRNA miR-15a-5p，而該miRNAd靶向作用於Inha，Acsl3，Kif21b和Igfbp2 基因。這些特異性表達的lncRNA和circRNA涉及許多生物過程，包括繁殖，調節幹細胞分化，生殖過程，遺傳印記調控，遺傳印記，細胞分化，性別分化，性染色質形成等。

圖9.ceRNA網路

小結

這篇文章的思路很清晰，大家可以借鑒一下：

1.lncRNA分析：對鑒定到的lncRNA進行常規信息的整理（包括數目、分布區域、分類、表達量等） 重點對性別特異性表達的lncRNA進行GO和KEGG分析 性別偏向表達的lncRNAs和mRNA共表達分析和功能預測；

2.circRNA分析：與lncRNA分析分析步驟基本一致；

3.構建ceRNA網路，找尋mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA調控關係。

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