陳昌福：提取免疫多糖預防水產動物病毒病作用

免疫多糖廣泛地分布於真菌、細菌和植物體內，微生物中的這種物質通常是能決定其疫苗抗原特異性的。如β-葡聚糖不僅是構築多種生物細胞壁的材料，而且在生物間相互影響的過程中也顯示出各種免疫生物學活性。近年來，為了避免各種化學藥物在水產養殖動物體內的殘留和對養殖水環境的污染問題，從各種生物中提取的免疫多糖類物質作為產業開發的重要對象而倍受關注。

迄今為止，對從真菌中提取的β-葡聚糖結構的研究已經有較多報道。有研究結果證明，由於免疫多糖的來源不同、材料的個體差異、對免疫多糖的提取方法和分析方法的不同，可以導致免疫多糖的細微結構存在差異，而且研究結果還證明了免疫多糖的分子結構正是決定其免疫學活性強與弱的關鍵所在。

一、免疫多糖的基本結構與高級結構

Yadomae等採用不同的提取和分離方法從不同菌類中獲得的免疫多糖(主要是β-葡聚糖)的結構與免疫生物學活性進行了比較研究，結果首先證明了從各種菌類中提取的β-葡聚糖結構的主鏈都是β-1，3和β-1，6結合物。從擔子菌和子囊菌中提取的具有免疫活性的β-葡聚糖大多是由β-1，3結合而構成的，側鏈雖然都是由β-葡聚糖的1個殘基構成的，但是因菌的種類不同而存在很大的分歧度，殘基數目的多少直接影響β-葡聚糖的各種生物學活性。用次氯酸鈉·二甲基亞碸(DMSO)法從真菌的細胞壁中提取可溶性的β-葡聚糖(CSBG)中，β-1，3長鏈上重合度的10%～50%是與β-1，6鏈結合，而且這種β-1，6鏈上還存在少量分支，對動物進行的試驗結果表明，此類β-葡聚糖對動物免疫系統就具有良好的激活作用。

β-1，3-葡聚糖的各種生物學活性均依賴於其分子的高級結構。將高分子量的β-1，3-葡聚糖在中性水溶液中以核磁共振光譜法(NMR)測定時，並不能檢測到以單鏈形式存在的β-葡聚糖分子。這種觀察結果與β-1，3-葡聚糖的螺旋結構特性是一致的。由於高分子量的β-1，3-斷片由氫鍵結合所介導的分子間作用很強，分子的運動性被抑制，因此，在NMR可能觀測的波長範圍內不能看到單鏈分子。但是，當溶液的鹼性不斷增加時，隨著分子間的相互作用減弱，溶液中單個分子也逐漸清晰可見，並且在約0.3摩爾/升的NaOH溶液中達到單個分子的觀察峰值。在這種條件下β-1，3-葡聚糖呈現黏度很低的凝膠狀態。用具有高分辨能力的NMR法對β-1，3-葡聚糖的溶液、凝膠和固體物進行觀察的結果表明，高分子量的β-1，3-葡聚糖主要以一重和三重螺旋兩種高級結構的形式存在，同時也存在由低分子或者帶電荷的分子構成的隨機鏈圈狀態。

如何快速檢測β-1，3-葡聚糖的結構，對於準確評價其生物學活性是十分重要的。因此，建立在水溶液中測定β-葡聚糖高級結構的簡便方法是很有必要的。鱟體液凝固系統能選擇性地與β-1，3-葡聚糖的一重螺旋和隨機鏈圈發生反應，因此可以利用該反應系統快速觀察其高級結構的變化過程。Nagi等依據該原理對β-1，3-葡聚糖進行分析的結果表明，其三重螺旋結構是相對穩定的，即使一旦成為一重螺旋結構的分子也會在溶液中逐漸變為三重螺旋的結構。從擔子菌中提取的分支β-1，3-葡聚糖即使在低溫條件下，也可能發生一重螺旋結構向三重螺旋結構的轉化過程。而CSBG只有在高壓滅菌條件下才能誘導其向三重螺旋結構的變化。β-1，3-葡聚糖在加壓條件下溫度達到130℃以上的水溶液中，可以變成隨機鏈圈形式，而且在不同的冷卻條件下，溶液中三重螺旋結構分子的比例也會出現明顯差異。

綜上所述，因為在不同的條件下β-葡聚糖的結構有所不同，所以，在評價其生物學活性時，闡明β-葡聚糖的結構與其各種生物學活性的關係是十分重要的。Aketagawa等利用鱟體液進行的鱟試驗替代日本藥局指定的發熱性物質試驗方法，完成了內毒素活性的測定，並成功地開發出了內毒素活性的快速測定方法。Obayashi等還發現在鱟體液中除含有C因子系統之外，還存在能與β-葡聚糖發生特異性反應的G因子系統。Tanaka等利用鱟體液中G因子系統的這種特性開發出了用於真菌病早期診斷的試劑盒。

二、免疫激活活性與結構的相關性

最初，β-1，3-葡聚糖作為抗腫瘤多糖而被注意。為了深入研究β-1，3-葡聚糖的結構與活性的關係，有人採用閉鎖菌落(closed colony)小鼠進行了試驗，證明了分子的分歧度與活性相關。由雷丸中提取的具有高分歧度的OL-2和從糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)中提取的無分歧的CRD均對惡性腫瘤的作用很弱，但是，一旦將羧基和羥基導入其中，兩者均可顯示出較強的抗腫瘤活性。

為了比較三重螺旋和一重螺旋的β-葡聚糖活性的差異，將醫用SPG(完全三重螺旋結構的β-葡聚糖)用鹼性溶液處理(SPG-OH)，變為一重螺旋的β-葡聚糖後，進行了免疫激活活性的比較。結果發現只有SPG-OH在干擾素(IFNγ)存在的條件下，能刺激巨噬細胞產生一氧化氮，SPG-OH刺激白細胞產生白細胞介素(interleukin, IL)-6(IL-6)的活性也較SPG強。將β-葡聚糖接種小鼠腹腔後的浸出細胞也對細胞產生一氧化氮有增強作用。

利用環磷醯胺（CY）注射小鼠製備的白血球減少症動物模型，比較SPG和SPG-OH的造血促進效果，結果表明兩者具有幾乎相同的效果。β-葡聚糖的造血促進作用被認為與IL-6生成量增加相關，在CY處理後的小鼠骨髓與脾臟細胞培養上清液中，經接種SPG和SPG-OH後的小鼠血清中IL-6的生成量顯著上升，在離體培養的經CY處理後的小鼠骨髓與脾臟細胞培液中添加SPG和SPG-OH後，也可以觀察到IL-6的生成量上升，這些結果均意味著β-葡聚糖的這種活性與三重螺旋結構的關係並不密切。

利用離體培養的人體末梢血單核細胞進行的試驗結果表明，SPG-OH誘導細胞產生IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF等細胞因子的活性較SPG強。在利用全血、單核細胞和粒細胞進行的試驗中，以IL-8生成量為指標進行比較的結果表明，雖然SPG-OH誘導細胞產生IL-8的活性較SPG強，但是後者與對照組相比，仍然存在有顯著性差異。迄今為止的研究結果表明，由於研究者所採用的評價指標不同，關於β-葡聚糖的生物學活性與分子結構相關性的結論仍然存在較大分歧。

抗腫瘤活性是β-葡聚糖的主要生物學活性指標，不過，除利用活體試驗進行評價外，建立準確的離體試驗評價系統的研究尚在探討中。Adachi等發現經CY處理並經β-葡聚糖誘導後小鼠骨髓與脾臟細胞只能產生IL-6和部分細胞因子，除這些對抗物外未觀察到在這種處理中β-葡聚糖的其它活性。

對β-葡聚糖的活性進行深入研究時，已知結構的β-葡聚糖標準品是必不可少的。SPG和酵母聚糖（ZYM）常被分別作為可溶性和顆粒性β-葡聚糖的標準品使用。眾所周知，ZYM作為炎症誘導物質的活性與顆粒性β-葡聚糖十分相似。Suzuki等對ZYM和β-葡聚糖的活性進行了比較研究，發現ZYM的側鏈不能用過碘酸氧化法切斷，但是，採用亞氯酸鈉將ZYM中的蛋白質除去後再用過碘酸氧化法處理，即可以將側鏈除去。將這種方法獲得的氧化ZYM（OX-ZYM）與ZYM的活性進行比較時，雖然兩者的抗腫瘤活性與激活補體的活性是一致的，但是，在離體條件下OX-ZYM刺激巨噬細胞產生腫瘤壞死因子（TNF）的活性顯著下降，而且OX-ZYM與ZYM接種後的小鼠脾細胞產生的特異性細胞因子失去反應性。

在離體試驗條件下，ZYM刺激免疫活性細胞產生過氧化氫（H2O2）的活性顯著高於CSBG，正是利用CSBG可以阻礙免疫活性細胞產生H2O2的特性，展開了β-葡聚糖受體的研究。CSBG已經被證明具有多種免疫生物學活性，其分子結構的溶解度差異在很大程度上與OX-ZYM相似。

三、β-葡聚糖對水產動物的免疫激活作用

Robertsen等的試驗結果證明，從酵母菌中提取的β-葡聚糖能增強大西洋鮭對滅鮭氣單胞菌、鰻弧菌和魯克氏耶爾森氏菌感染的抵抗力。Chen等的報道指出，注射β-葡聚糖能提高斑點叉尾鮰抗叉尾鮰愛德華氏菌感染的能力。Anderson等採用注射和浸泡法對溪紅點鱒接種免疫多糖後，試驗魚對人工感染滅鮭氣單胞菌活菌的抵抗力顯著增強。Brattgjerd等對大西洋鮭注射酵母葡聚糖後，發現試驗魚的巨噬細胞在離體條件下的吞噬活性和產生H2O2量上升。Jeney等將葡聚糖作為佐劑與滅鮭氣單胞菌滅活菌苗聯合使用，結果證明能顯著提高供試虹鱒的非特異性免疫力。Kawakami等分別用滅活的鰻弧菌菌苗、真菌葡聚糖、幾丁質和福氏完全佐劑接種五條鰤後，發現各種處理的受免魚均對殺魚巴斯德氏菌感染的抵抗力顯著增強。Samuel等的試驗結果證明β-葡聚糖能顯著增強毛足鱸對滅鮭氣單胞菌感染的抵抗力。Engstad等的研究證明了大西洋鮭的巨噬細胞上存在β-葡聚糖的受體。

β-葡聚糖具有特異性的螺旋結構，而且這種結構在某種程度上是可以控制的。較長期時期以來，β-葡聚糖的抗腫瘤活性被認為是與其三重螺旋結構相關的，然而，針對β-1，3-葡聚糖的活性開展的大量研究結果證明，一重螺旋結構甚至隨機鏈圈的β-葡聚糖也具有較強的抗腫瘤活性，其免疫調節作用不僅限於三重螺旋結構的β-1，3-葡聚糖。具有不同結構的β-葡聚糖的免疫調節活性強弱是有所不同的。

為了深入研究β-葡聚糖的免疫調節活性，目前關於β-1，3-葡聚糖受體的研究也獲得一些新進展。製備CR3變體後在離體條件下與CR3的活性進行比較研究的結果表明，當白細胞表面存在已經被β-葡聚糖激活後的CR3時，該白細胞對細胞上形成了免疫複合體的腫瘤細胞具有明顯的殺傷力。用缺乏CR3的小鼠進行的試驗結果也證明對β-1，3-葡聚糖在其血液中的變化速率有顯著差異。β-1，3-葡聚糖對於表面不存在CR3的細胞也具有激活作用，這種研究結果預示著β-葡聚糖對免疫細胞的激活還可以通過另外的受體。

β-葡聚糖雖然已經被證明具有多種生物學活性，但是對這些「共同活性」進行細分則較為困難。為了有效地利用β-葡聚糖，究竟以何種活性指標作為判斷標準，還有待更深入地研究。此外，β-葡聚糖在環境中大量存在，也可能是誘發疾病的因素之一，因此，通過深入研究β-葡聚糖的各種生物學活性，尋求控制各種真菌的方法也是值得探討的研究方向。

華中農業大學水產學院 陳昌福

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！