做流式，除了你的實驗組對照外，還需要準備哪些對照？

隨著流式細胞技術的不斷更新，應用也越來越廣泛。

今天，我們來說說做流式檢測，除了實驗組對照外，還有些對照是必不可少的。

1. 陰性對照：空白對照能否代替同型對照？

陰性對照通常來說就是我們說的背景信號，很多人認為可以用空白對照當作背景信號，其實不然。

流式細胞樣品的熒光=細胞自發熒光+非特異熒光+特意熒光，背景信號即細胞自發熒光和抗體與細胞的非特異熒光。

細胞自發熒光-空白對照：不經熒光染色細胞內部熒光分子經光照發出的熒光。自發熒光信號為雜訊信號。一般說來，細胞成分中能產生自發熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越高自發熒光越強。

非特異熒光：抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結合上的熒光染料受光照發出的熒光。

特異熒光：即抗體F(ab』)2段與細胞抗原特異結合上的熒光染料受光照發出的熒光。

同型對照：同型對照=自發熒光（空白對照）+非特異熒光

同型抗體：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同， F(ab』)2段不同）

同型抗體與染色的單克隆抗體：相同種屬來源、相同免疫球蛋白及亞型、相同熒光素標記、相同劑量和濃度、但由未免疫動物血清純化而來

用於消除由於抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體而產生的背景染色

綜上，同型對照樣本不能完全替代空白對照。

2.補償對照

熒光補償（compensation）是指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素髮射光譜重疊（spectral overlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。

補償對照：雙色或多色分析中，熒光素髮射光譜重疊必須設置補償對照樣本。

熒光補償（compensation）使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其餘熒光素對應的同型對照抗體分別進行染色，幾色分析需要製備幾個補償對照管。

關於補償對熒光的影響，從圖中我們就可以看到，下面舉例幾張圖片，補償不足的樣品，有時會對樣品的陽性率有很大影響，做好補償對照，才可以消除假陽性對結果的影響。

3.熒光減—對照（FMO）

是一種設門對照，是指在多色分析（4-6色以上）時，對某個通道特別設置的陰性對照，包含除待檢測指標外的所有熒光抗體，對於分群不明顯的檢測指標的設門尤為重要。FMO對照能夠排除其他熒光素對該通道的影響，準確的劃分陰性群體，從而有效避免由設門不準導致的實驗重複性降低，統計方差升高等問題。FMO對照還能夠對抗體的穩定性進行監測，特別是耦合熒光素抗體，以避免因抗體熒光衰退造成的假陰性。

舉個常用的例子，告訴大家一個基本的實驗對照該如何設置。

註：

樣品1為同型對照樣本-細胞自發熒光和非特異熒光（背景）

樣品2、3、4為三色實驗的補償對照樣品-消除三種染料之間的相互影響

樣品5為實驗樣本，其中應該包括實驗設計中的實驗對照、樣本等。

中心實驗室現有的流式細胞儀是BD AiraII，三激光9色分選型，歡迎大家前來交流。

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