第三代測序技術，即單分子測序技術，又稱納米孔測序，以美國太平洋生物（Pacific Biosciences）的 SMRT 技術為代表。DNA 測序時，不需要經過 PCR 擴增，實現對每一條 DNA 分子的單獨測序。

SMRT 測序面臨的一個挑戰是將更長的 DNA 分子放入 100 納米大小的零模波導孔（ZMW）。目前，DNA 模板必須通過生物親和素固定到 ZMW 上，DNA 分子會以自己的方式擴散到 ZMW，而這個過程更利於短 DNA 片段。多年來，PacBio 公司一直在改進工藝，但所需 DNA 樣本量仍然高於納克水平。（歡迎關注Science微信號：bioeg_cn）

近日，PacBio 公司和美國東北大學的研究人員證明，納米孔與 PacBio 測序系統結合的技術經改造後，可以優先載入長 DNA 分子，並且減少所需 DNA 樣本量。

9 月 11 日，該研究發表在 Nature Nanotechnology（IF：38.986），這是由美國國家人類基因組研究所資助的一項為期 3 年的研究項目成果之一。

該研究小組 2014 年公布了這項工作的第一個成果，成功構建了混合納米孔和 ZMW 的配置，DNA 可以通過這個結構載入測序系統。現在，研究人員證明該方法是可行的，長 DNA 分子也可以測序並讀出，更重要的是，所需 DNA 樣本量少於通常 PacBio 測序所需樣本量。

美國東北大學物理學副教授、該研究的資深作者 Meni Wanunu 表示：「這仍然是一個概念證明」。研究團隊與 PacBio 公司合作的目標是找出一種方法減少系統所需 DNA 樣本量並優先載入較長 DNA 分子。

如何達到這樣的目的呢？

Wanunu 團隊的辦法是在每個 ZMW 底部設置納米孔製成 NZMWs，並施加電壓驅動 DNA 通過納米孔。Wanunu 說，這樣的結構能夠大量載入 DNA 並優先載入更長的 DNA 片段。

研究小組利用六個 NZMWs 進行試驗，研究了從 1kb 到 48.5kb 的 DNA 片段如何被 NZMWs 捕獲。團隊證明，10 皮克的 DNA 樣本可以在不到一分鐘的時間載入完成。而傳統方法載入 10kb 的 SMRTbell 樣品需要輸入 1.5 微克的 DNA，要花費 1 小時。

傳統 PacBio 測序，DNA 模板是與 DNA 聚合酶鏈親和素融合蛋白結合在一起，然後蛋白結合波導上的生物素基團，進行測序。研究小組證明可以在 NZMWs 構建類似 DNA 聚合酶鏈複合物捕獲 DNA，進行測序。

NZMW 與 ZMW 相比有什麼優勢？

研究人員比較了 NZMW 與 ZMW 測序情況。添加模板 DNA 與熒游標記的核苷酸，測試了 72 個基本的環狀 DNA 和 DNA 聚合酶模板。研究人員使用電壓脈衝將聚合酶激活，進行熒光測序，發現熒光光陣只出現在 NZMWs，也就是說在短短的 3 秒載入時間內，DNA 模板就被載入到 NZMWs，而沒有 DNA 被載入到 ZMWs。

最後，研究人員展示了一個已知的 20kb SMRTbell 序列的測序。他們用不到 1 納克的 DNA 樣本，施加 2 秒電壓脈衝，就將 DNA 載入到了 NZMW。

Wanunu 說，團隊下一步將繼續優化設計包括放大 NZMW 設計，為每個 ZMW 納米孔構建晶片，使每個 NZMW 不需要單獨製作。

此外，Wanunu 團隊也與 PacBio 合作開發直接 RNA 測序技術。Wanunu 表示，計劃把研究重點放在用 NZMW 裝置進行直接 RNA 測序，「一旦達到 DNA 和 RNA 的高質量測序目的，我們就可以與 PacBio 的儀器一體化，這之前，我們還有一段路要走。」

PacBio 的首席科學官 Jonas Korlach，拒絕討論該公司是否計劃將 nanopore ZMWs（NZMWs）作為其商業平台的技術優化方向。他聲明，在 Nature Nanotechnology 發表的研究不以任何方式反映任何有關當前或未來 SMRT 測序平台商業實現或特點的預測。

來源：測序中國/王迪

參考資料：Length-independent DNA packing into nanopore zero-mode waveguides for low-input DNA sequencing

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