Nature：Jennifer A.Doudna再一次開發新的CRISPR系統
iNature：來自鏈球菌的RNA介導的CRISPR-Cas9核酸酶（SpCas9）已廣泛用於基因組編輯。高保真（SpCas9-HF1）和增強的特異性（eSpCas9（1.1））變體在人類細胞切割DNA表現出顯著降低的脫靶作用，但靶向的偏好性的機制及怎麼進一步提高保真度還是未知的。運用單分子F?rster共振能量轉移（smFRET）實驗表明，SpCas9-HF1和eSpCas9（1.1）結合到不匹配的序列時，它們會處於非活動狀態。Doudna研究組發現Cas9的非催化結構域REC3，可以識別目標互補序列並控制HNH核酸酶的活性並且調節Cas9總體催化能力。利用這一觀察，Doudna研究組設計了一種新的超精準Cas9變體（HypaCas9）顯示出高度的全基因組特異性而不會降低人類細胞中的靶向活性。這些結果提供了為後續的進一步精確基因編輯提供了嚮導。
來自鏈球菌的RNA介導的CRISPR-Cas9核酸酶（SpCas9）已廣泛用於基因組編輯【1-4】。高保真（SpCas9-HF1）和增強的特異性（eSpCas9（1.1））變體在人類細胞切割DNA表現出顯著降低的脫靶作用，但靶向的偏好性的機制及怎麼進一步提高保真度還是未知的【5-9】。
運用單分子F?rster共振能量轉移（smFRET）實驗表明，SpCas9-HF1和eSpCas9（1.1）結合到不匹配的序列時，它們會處於非活動狀態。Doudna研究組發現Cas9的非催化結構域REC3，可以識別目標互補序列並控制HNH核酸酶的活性並且調節Cas9總體催化能力。利用這一觀察，Doudna研究組設計了一種新的超精準Cas9變體（HypaCas9）顯示出高度的全基因組特異性而不會降低人類細胞中的靶向活性。
我們的研究結果提供了直接證據支持以前的Cas9依靠PAM及guide RNA來實現準確檢測DNA序列【10，11】。我們表明REC3結合RNA-DNA雙鏈體是重新定向REC2所必需的，這又使HNH錨定在活性位點上。REC3內部氨基酸的突變（涉及RNA / DNA異源雙鏈體識別，如在HypaCas9/SpCas9-HF1中的突變)，將會阻止REC2結構域的轉換，使在不匹配的情況下行使Cas9酶的活性，這進一步增加了脫靶效應。奇怪的是，幾乎所有的氨基酸集群突變都是非常的保守，表明這些殘基也可能參與protospacer 的探測。此外，可以解釋自然界顯然沒有選擇一個高度精確的Cas9蛋白，宿主要使耐受性和特異性倆者之間達到平衡。
我們的研究描述了通過改進Cas9特異性的一般策略，即調整自然構象閾值，用於合理設計超精準Cas9變體，並且不會降低其效率。
延伸閱讀
重磅推薦Nature揭示新的體內蛋白相互作用方法（可廣泛使用在各個物種）（FRET方法介紹）
http://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature24268.html
通訊作者簡介
Jennifer A. Doudna
Doudna教授於1964年生，在1985年從波莫納學院獲得化學專業的學士學位，在哈佛大學獲得生物化學博士學位，研究方向是核糖體酶，其導師是諾貝爾獎獲得者Jack W. Szostak；之後在克羅多拉大學跟著諾貝爾獎獲得者Thomas Cech從事博士後研究工作；從1997年起，Doudna成為HHMI研究員；2000年，Doudna被推薦為耶魯大學分子生物物理及生物化學部門的Henry Ford II教授；2002年，Doudna接受了加州伯克利大學的分子與生物化學的教授，這樣可以離她家更近，在2012年，Doudna及其同事發現了CRISPR-cas9系統。在2001年，Doudna獲得在生物化學方面獲得Eli Lilly Award ；2013年獲得美國分子與生物化學學會頒發的Mildred Cohn Award；2014年同張豐及 Emmanuelle Charpentier共同獲得Jacob Heskel Gabbay Award，另外還獲得了NIH資助的Lurie 獎，同Emmanuelle Charpentier共同獲得Dr. Paul Janssen獎及生命科學突破獎；在2015年，同Emmanuelle Charpentier共同獲得Princess of Asturias 獎及Gruber Prize；2016年，獲得了唐等獎項，並且被選為英國皇家外籍院士；2017又收穫了 Japan獎，F. Albert Cotton 獎章， Albany Medical Center獎。Doudna實驗室最主要的研究方向是CRISPR-cas 9的產生作用的機理以及在科研中的應用，這主要又包括三個方面：
1.細菌的免疫作用；
2.RNA干擾；
3.翻譯控制。
在CRISPR-cas 9方面，同Emmanuelle Charpentier及張豐並稱為CRISPR三劍客，在這個領域中做出了卓越的貢獻。Doudna在Nature，Cell，Science 等頂尖雜誌發表了180篇文章，其領導的實驗室在CRISPR-cas 9的機理及應用等方面的研究碩果累累，在國際上享有盛譽。
參考文獻
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