HPLC方法驗證時的幾點注意事項
一、方法驗證的趨勢
WHO、FDA、USP 和ISO 17025 對於分析方法驗證的定義和解釋基本一致，其核心是實驗室通過試驗設計和測試，證明被驗證的方法適用於該方法擬定的檢測用途。分析方法要求具有專屬、準確、耐用、重現性好的特點，不同的實驗室對方法驗證的具體做法和可接受標準往往是不同的，但是，基本都會根據官方指導原則或藥典通則規定進行方法學驗證，並符合GMP要求。
不同國際組織和藥典要求的方法學驗證參數
需要注意的是，2015版中國藥典通則9101《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》中增加了「校正因子」的驗證，詳見下表。
ChP2015檢驗項目和驗證指標
CDE電子刊物《HPLC法校正因子研究中的幾個問題》一文記載，在一般情況下，校正因子可視具體情況通過如下幾種方法測定：
（1）單濃度點測定
（2）多濃度點測定
（3）標準曲線法測定
（4）吸收係數比值法
其中，（1）和（2）法較為簡捷，可以快捷地量化特定雜質與主成分紫外吸收特徵的差異，多用於評估採用主成分自身對照法定量雜質時是否需要校正。但如採用加校正因子的主成分自身對照法定量雜質，需將標準物質賦值信息轉化為校正因子固化在質量標準中，那麼校正因子的準確性非常關鍵，校正因子的準確計算應符合更為嚴格的要求，需要考慮並控制求算校正因子過程中的各種誤差因素，以及儀器通用性和色譜系統的耐用性等因素，以便使求得的常數更為準確並具代表性，此時採用（3）、（4）法更為適宜，如能考慮到測定人員、不同試驗室因素的影響，會更加符合常數求算的基本要求。
此外，本公眾號《【案例分析】一文看透「校正因子」的影響因素》一文中介紹了不同色譜柱、流速、pH值、柱溫、緩衝液濃度、檢測波長、不同檢測器（UV和PDA）、不同溶劑級別等的改變可引起校正因子的變化，提示在HPLC方法開發和校正因子的驗證中應注意考慮。
通過上述介紹不難發現，方法學驗證不僅僅是完成某個指標（如回收率、重複性）的驗證。指導原則或藥典沒有規定每個具體驗證指標的試驗方法，原料葯、製劑、劑型、正相色譜、反相色譜、甚至不同公司SOP規定的不同都會引起結果的差異和準確性。例如回收率，有時會出現由於實驗設計方法不同、對指導原則或藥典理解的不同而產生不同的試驗結果，或符合要求，或不符合要求，而究竟哪個是「科學合理」的，仁者見仁智者見智。
實驗設計（方案）的多樣性、對樣品從取樣到檢測完畢這個過程的研究深度、是否對檢測過程中的「異常」問題進行深入分析等，往往會對最終測定結果的準確性產生影響甚至會致使「超標」現象。例如：文章《辛伐他汀片的含量測定中研磨對含量結果的影響》報道，日常檢驗中發現辛伐他汀片同一批成品的含量與同批顆粒的含量偏低4%左右。從顆粒到壓片的過程，從理論上講不應該出現主葯含量下降的情況，並且檢驗過程無誤。由於在檢驗過程中顆粒和成品的區別只有研磨時間和難易程度不同，所以從研磨方面查找原因。結果表明，辛伐他汀片在含量測定過程中，取20片研磨稱取細粉測定含量的結果與不研磨而是直接稱取整片測定含量的結果比較相差較大。研究發現研磨程度和研缽大小都會有一定影響，所以應取用相同材質和同樣大小的研缽，並且用力均一。研磨樣品應都取20 片，防止樣品的研磨量不同引起誤差。5mg規格辛伐他汀片應直接稱取4 片進行測定。部分代表性數據如下：
所以，在方法建立和方法驗證階段，採用簡單、傳統的研究思路和實驗設計可能不能保證日後的測定結果的準確性和使用目的，我們需要在做驗證時考慮更加細緻，通過大量的比較研究、科學地去設計方案、模擬實際情況，開展方法驗證。
2016年10月14日，USP發布了一個新的通則「分析方法生命周期」 The Analytical Procedure Lifecycle 徵求意見稿，並發表在美國藥典論壇43（1）【2017年1-2月】上。其中的理念與ICH Q8、Q9、Q10和Q11所述的質量源於設計的理念一致。這是一個新的方法驗證思路，值得我們學習和借鑒。
例如在USP 中規定，將分析方法的整個生命周期劃分為三個階段。
Stage1: Procedure Design and Development (Knowledge Gathering, Risk Assessment, Analytical Control Strategy, Knowledge Management, Preparing for Qualification)
第1段：方法設計和開發（知識收集、風險評估、分析控制策略、知識管理、確認準備）
Stage2: Procedure Performance Qualification
第2段：分析方法性能確認
Stage3: Continued Procedure Performance Verification (Routine Monitoring, Changes to an Analytical Procedure)
第3段：持續方法性能確認（日常監測，分析方法變更）
分析方法生命周期中的一個基本要素是制訂一個目標說明對分析方法的性能要求。這些在分析目標概況（ATP）中描述的要求可以看作是類似於產品質量目標要求（QTPP）。在ATP中，我們需要研究和控制各種不確定度，研究可能產生偏差（如專屬性、線性、提取回收率、濾膜驗證、檢測波長、溶液穩定性、分析物的溶解度）和提高方法精密度的因素（如樣品製備過程、稱量、儀器、積分、背景噪音、重複次數、操作人員）。
如果採用新的研究思路，會要求應用新的實驗設計。如文獻《基於Q2（R1）理念的藥品質量分析方法驗證新概念》報道，在進行線性試驗時，可根據ICH要求, 配製5種濃度水平來評估，根據eNvoal的要求, 至少需要獨立的3個序列, 且每個序列至少重複3次，實驗設計如下表所示。
實驗設計要求目標
在整個實驗過程中, 範圍、準確度、精密度、線性和定量限被涵蓋, 其中準確度和精密度能夠通過eNvoal軟體一次性評估。為了得到在一定置信區間內各個濃度水平某個單個測試結果的預測區間，需要通過專業的統計軟體來完成。
通過eNvoal引入了準確性特徵值的概念，是整個濃度範圍的預測模式, 涵蓋了準確性、準確性、精密度和定量限。推斷預測區間和風險評估, 也可提供一般統計數據(平均值、RSD等)。濃度範圍的預測的準確性和特徵值，見下圖。
濃度範圍預測的準確性和特徵值曲線圖
通過eNvoal能夠非常容易判斷出來該分析方法是否適用於檢測的要求。eNvoal結果判斷見下圖。
eNvoal結果判斷方法的有效性示意圖
eNvoal結果判斷方法的無效性示意圖
以上例子說明，與傳統的驗證方法相比，新的驗證方法實驗設計更加統一，驗證後的方法更加可信，是方法驗證的新趨勢。
二、方法驗證時需要注意的因素
對於一個分析方法需要考慮三方面因素，Sample Preparation、Measurement、Replicate Strategy。
在樣品的製備環節，一般包括稱量、提取、稀釋等環節，但是取樣的代表性有時也影響結果的準確性，這種影響是不能忽視的，例如出現製劑成品含量合格，中間產品含量不合格的情況往往是由於取樣過程中的問題引起的，在研究時應將這個環節進行詳細分解研究。在溶液製備的過程中有兩個因素很關鍵，一個是樣品溶解/提取/溶出的是否完全，另一個是溶液的穩定性。為了保證待測成分提取完全/不被破壞，就要考慮加入的藥物的量、是否存在靜電吸附、溶劑體積、提取方式，提取時間、提取溫度、是否避光操作等因素。
在測量這個環節，以HPLC為例，受到樣品溶液、對照品溶液、儀器性能、檢測器類型或能量、檢測波長、檢測器的參數設置、計算公式、線性範圍、溶劑峰（或輔料峰）、試劑純度、色譜柱、甚至樣品小瓶等的影響，總之變數因素非常多，遇到異常問題時可以採用魚骨圖等方式進行分解研究，如下圖。
方法的重現性控制策略在方法的建立、優化、驗證時就應該重要考慮，比如供試品溶液的製備方法的重現性、雜質峰相對保留時間的重現性、雜質校正因子的重現性、主峰保留時間的重現性、雜質間分離度的重現性，這些項目中的影響因素需要考慮。例如樣品溶液是否受量瓶體積的影響、加入溶劑量的影響、取樣量的影響；保留時間是否受到不同色譜柱的影響、相同色譜柱不同粒徑或不同品牌的的影響等；分離度是否受到流速、柱溫、儀器死體積的影響等。
圍繞上述三個環節，列舉幾個方法驗證中有時需要注意的因素：
1、是否有一個溝通良好的項目討論小組。例如小組成員可包括合成、分析、製劑等。合成人員負責雜質譜的分析、雜質製備、結構確證、譜圖解析、包裝等；分析人員負責方法摸索、驗證、雜質標定、雜質質量標準建立等；製劑人員負責提供空白輔料、相容性信息、製劑樣品。大家的目的是相同的，即保證方法驗證及其相關工作順利進行，對於雜質譜分析和雜誌控制策略往往需要大家一起討論制定。
2、明確分析方法的使用目的和應用範圍。方法是用於測定什麼的？是測定含量、雜質、溶出度的還是做鑒別的，也就是說定量和定性的，目的不同，驗證的內容也就不同。
3、明確樣品類型、方法類型。樣品是起始物料、中間體、反應液、原料葯、還是製劑？例如對於原料和製劑來講，二者對方法的影響是不一樣的，製劑中的輔料常常會對方法造成干擾，如出現輔料峰、輔料引入的雜質峰，還要考慮輔料對主葯的影響，以及溶劑提取、供試品溶液的製備方法是否合適。對於中間體、反應液等有時可能不需要準確定量、精密稱取。預計使用的雜質計算方法是外標法、自身對照法、還是歸一化法？
4、開展預驗證試驗和研究。在研究開始時分析儀器應經過DQ、IQ、OQ、PQ的確認，如對於HPLC，UV、溶出度儀進行校驗，這是方法學驗證的基礎（如下圖所示）。每次分析前進行系統適用性試驗，保證系統性能符合要求。
要考察對照品溶液、供試品溶液、溶劑、流動相等的穩定性情況，一般要求至少24h穩定，找到敏感因素，並控制這些因素，如溫度、光等。確定系統適用性的評價方式和指標，如採用峰鑒別對照品溶液、破壞溶液、還是對照品混合溶液？採用分離度、相對保留時間、主峰保留時間、理論板數、拖尾因子，還是RSD進行評價？要通過專屬性、降解試驗（或混合降解溶液）等評價色譜柱，確定廠家、品牌、固定相種類等。基線波動、漂移、出現鬼峰等是梯度洗脫中常見的問題，導致在扣除溶劑峰時遇到問題。這時可以從試劑純度、流動相使用時間、平衡時間、雜質捕集柱等方面考慮。如使用高純度的試劑、水，帶有緩衝鹽的流動相現配現用，不超過48h內使用；梯度洗脫後要摸索平衡時間，選擇一個合適的時間如5、10min等。當遇到鬼峰很多的情況，可以使用流動相雜質捕集小柱，如月旭科技Ghost-Buster Column流動相雜質捕集小柱安裝在梯度混合器和進樣器之間，不僅能夠去除流動相中的雜質，還可以有效去除管路和混合器中的雜質。下圖為不加 Ghost-Buster流動相雜質捕集柱(a)和加Ghost-Buster流動相雜質捕集柱(b)對比色譜圖。
對於HPLC法的LOD和LOQ，有時受色譜圖的形狀影響很大，需要注意色譜柱的品牌和柱效，如下圖所示。有些方法參數的研究可以嘗試使用實驗設計（DOE）進行研究。
5、預驗證結束後可以起草一個方法的SOP和藥典格式的質量標準草案，並起草方法學驗證方案，儘可能詳細的列出操作步驟，便於操作和重複，列出各項驗證指標可接受的範圍。例如列出色譜柱的詳細信息、樣品信息、對照品信息、儀器信息、溶劑配製詳細步驟和過程、所用試劑的級別和廠家、過濾器的類型和大小等、進樣順序表等，試驗中應嚴格遵守SOP規定。
6、方法驗證結束後要及時匯總結果，整理驗證報告，並經過複核和審核，將驗證報告和記錄等存檔。但是，驗證通過往往不代表後期檢驗樣品時沒有問題，仍需要對方法進行持續跟蹤、完善，關注樣品檢測時遇到的新的問題，有時可能需要對方法進行補充研究，進行追加驗證或再驗證。
綜上所述，藥品檢驗的分析方法來源於合理的設計，要保證操作過程嚴謹科學。USP、2015年版的《FDA分析方法驗證指南》、美國藥典論壇中的文章如Analytical Target Profile: Structure and Application throughout the Analytical Lifecycle、Analytical Control Strategy、Lifecycle Management of Analytical Procedures: Method Development, Procedure Performance Qualification, and Procedure Performance Verification、Fitness for Use: Decision Rules and Target Measurement Uncertainty等文章對於方法建立、驗證、管理具有一定的指導意義。質量研究人員可借鑒其中的思想，領會新的驗證思路，同時在觀察到異常現象後，主動查找原因，找到問題的解決辦法，可對方法的控制策略有深刻的理解。
三、參考文獻
1、分析方法驗證、轉移和確認概念分析
2、CDE電子刊物《HPLC法校正因子研究中的幾個問題》
3、辛伐他汀片的含量測定匯總研磨對含量結果的影響
4、基於Q2（R1）理念的藥品質量分析方法驗證新概念
5、USP : The Analytical Procedure Lifecycle
6、USPPF: Analytical Control Strategy
排版：梅希
更多乾貨請進葯事縱橫主頁：www.pharmaguider.cn
TAG:葯事縱橫 |