肝細胞癌：肝細胞和乙型肝炎病毒的共同進化

文章來源：中華肝臟病雜誌, 2017,25(05): 321-324

作者：楊帆 馬龍騰 曹廣文

摘要

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝細胞癌（HCC）發生的主要原因。在HBV感染至HCC發生過程中存在肝細胞和HBV共同進化的現象，肝細胞進化具體體現為去分化和逆向進化，而HBV進化具體體現為"末路進化" 。由於HBV進化的發生早於HCC發生，因此，兩者的相互作用主要體現在HBV突變對HCC進化的促進作用。現擬對癌症進化發育學這一新興學說進行簡要概述，並從進化角度闡述HBV致癌的分子機制。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染已成為重要的公共衛生學問題，正嚴重影響著國民的健康水平和生活質量。其慢性感染是我國肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要原因。據統計，全球約3/4的HCC由HBV慢性感染所致[1]。我國大陸地區人口佔全世界的1/5，HBV慢性感染者佔全球的1/3，肝癌患者佔全球的1/2[2]。相關流行病學研究結果顯示，病例-對照研究的比值比（OR值）為5～ 49，隊列研究的相對風險度（RR值）為7～98[3]。而相比之下，大多數全基因組關聯研究（genome-wide association studies, GWAS）顯示單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms, SNP）與大多數人類癌症之間的關聯程度較低，OR值僅為1.0 ～ 1.3[4]。HBV的致肝癌機制已被廣泛研究，並取得了很大進展，我們在長期研究慢性HBV感染相關HCC過程中，提出了"癌症進化發育學"的基本理論[5,6,7]。在HBV感染相關HCC發生、發展過程中，存在肝細胞與HBV共同進化的現象。深入研究兩者相互作用的關係不僅可以完善"癌症進化發育學"理論體系，而且可以更加深入地理解肝炎向早期肝癌進化的分子機制，對HCC針對性預防和個體化治療，降低發病率和病死率方面具有現實意義。

通常來講，惡性腫瘤是由體細胞突變的產生和積累引起，這一過程遵循"變異-選擇-適應"的達爾文進化規律。癌症進化發育學理論是為闡明慢性炎症惡性轉化過程而提出的新學說。從"癌症進化發育學"這一全新角度進行分析可以看出，HBV慢性感染引起的炎症不僅可以誘導HBV和肝組織體細胞突變的產生，而且為二者提供微環境選擇壓力，促進HBV與肝細胞的共同進化。本文以HBV感染相關HCC這一經典炎-癌轉化實例的研究為線索，梳理了癌症進化發育學說的基本概念和理論框架，並從該學說的角度重新審視這一炎-癌轉化過程。

一、癌症進化發育學理論概述

炎症相關癌前病變向癌症轉化以及癌症複發和轉移的進化過程伴隨著一系列重要分子事件的發生。這些分子事件包括體細胞突變、表觀遺傳修飾以及由此引發的信號通路網路改變。先天遺傳因素和後天環境因素協同作用導致的免疫平衡持續失調，引發並維持了慢性非可控性炎症，為癌症進化和發展過程提供了基本微環境。在該環境中，核因子-κB等促炎因子的長期刺激可以反式激活人載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽等核酸編輯酶的表達，打破DNA突變和DNA突變修復之間的動態平衡，促進體細胞突變的產生和積累。絕大多數突變細胞被微環境選擇壓力清除淘汰，而一小部分突變細胞通過改變原有關鍵信號通路轉導模式，完成上皮-間質轉化，獲得了幹細胞特徵，得以在惡劣的慢性炎症條件下存活並逐漸演變成腫瘤起始細胞。炎症分子還可通過修飾甲基轉移酶，進而改變基因表達譜，以適應嚴酷的炎症微環境[8]。只有適應炎症微環境的變異細胞才能夠生存下來，稱為腫瘤起始細胞，腫瘤起始細胞的克隆性增殖可以引起腫瘤發生，同時在炎症微環境、腫瘤細胞生存競爭以及治療壓力的作用下還會繼續進化，產生具有耐葯、複發和轉移等惡性潛能的細胞亞群[7,9,10]。

自寒武紀生命大暴發以來，生物進化的基本方式是從單細胞生物向多細胞生物、從水生向陸生進化。而人類由受精卵在短短10個月內向成熟個體發展的胚胎髮育過程演繹了人類漫長的進化過程。"進化"和"發育"不但形態學上有某些相似性，而且都是由生命活動的最保守基因所主導，如Hox、Myc等[11,12]。我們認為這一過程是"進化發育過程" 。隨著分娩時嬰兒的一聲啼哭，也就是由"水生"進入"陸生"後，這些在胚胎時期起關鍵作用的蛋白質表達被封閉，在後續生命過程中不再表達。但在癌症發生後，此類蛋白可重新表達，可作為癌症標誌物。目前發現的絕大多數癌症標誌物均是胚胎時期表達的蛋白。其中最經典的當屬甲胎蛋白，在胚胎期肝組織內高表達並與幹細胞特性相關，已用於臨床肝癌的篩查與輔助診斷。近年來發現的幹細胞因子SALL4，是維持胚胎幹細胞多能性和自我更新的關鍵因子，在生理條件下僅可在人胎肝中檢測到，在某些HCC組織可發生再表達。SALL4的高表達與腫瘤細胞的"乾性"有關，高表達SALL4的HCC容易發生早期侵襲，預後不良[13]。人類在由受精卵向成熟個體發展的胚胎髮育過程中，幹細胞向組織特異性細胞分化，形成不同組織和器官。而腫瘤細胞的發生、發展過程與胚胎髮育過程正相反：來源於高度分化組織的變異細胞，經過去分化過程，逐步獲得乾性特徵並發展為腫瘤幹細胞，後者造成腫瘤轉移和複發。在惡性腫瘤組織中，大多數細胞是高度分化的，並且具有有限的增殖活性，僅有一小部分細胞具有幹細胞的特徵，稱為癌症起始細胞，是腫瘤組織中的主要惡性亞群。這表明癌症進化過程具有"去分化"和"逆向進化"特徵。

二、肝細胞向HCC的進化發育過程

癌症進化發育學的兩大基石是可遺傳變異的持續產生和選擇。腫瘤細胞的一大特徵是高突變率，其突變率比正常細胞高100～500倍。隨著新一代測序技術的發展，從基因組和轉錄組層面全面了解HCC進化發育過程中體細胞突變規律已成為可能。HCC相關突變基因主要發生於染色質重塑基因（ARID1A、ARID1B和ARID2）、P53 / RB抑癌信號通路（IRF2、TP53和CDKN2A）、Wnt /β-連環蛋白（β-catenin）信號通路（RPS6KA3-AXIN1和NFE2L2 -CTNNB1）和RAS / PI3K信號通路（PTEN、PIK3CA、K-RAS和N-RAS）[5,14,15]。以上這些基因突變中，大多數是在HCC進化晚期患者腫瘤組織中發現的，進化早期HCC以及癌前病變中體細胞突變的系統研究較少。HCC以及其癌前病變肝硬化組織中，均存在端粒酶啟動子區的突變，且突變頻率隨著癌症進化發育過程逐漸升高（肝硬化25%、肝臟腺瘤44%、HCC 59%），該基因的突變與CTNNB1的激活突變顯著相關[15]。HCC體細胞突變與已知的HCC危險因素存在密切聯繫。例如，抑癌基因IRF2的失活突變僅存在於HBV感染相關HCC中，可以引起p53功能障礙[14]。在酒精性HCC患者中，體細胞突變主要發生於染色質重塑基因，而且突變率很高[16]。以上研究結果證實，某些特定的體細胞突變可以驅動HCC癌前病變（肝硬化）向HCC的進化。癌症基因組研究表明，HCC的體細胞突變比許多其他類型癌症的體細胞突變更複雜[17]。究其原因,一方面在於HCC漫長的進化發育過程中優勢突變的不斷變化，另一方面在於HBV突變株與體細胞突變之間的相互作用。

三、HBV的"末路進化"

HBV屬嗜肝病毒科，在長期進化中高度保守。遺傳進化分析表明，人類HBV與猿類嗜肝病毒可歸為相同的進化分枝[18]。而相比之下，HBV感染人體後，在宿主炎症免疫微環境的選擇壓力下，HBV基因組的進化速度將顯著提升。基於前期研究中2 000例無癥狀HBsAg攜帶者的HBV基因組序列，我們建立了HBV野生型序列（標準序列）。在此標準序列基礎上，我們對HCC相關突變及其發生順序進行了研究，發現增加HCC風險的HBV突變主要分布於HBV基因組的增強子Ⅱ/基礎核心啟動子區/前核心（EnhⅡ/ BCP / PC）以及preS區域[19,20,21]。而且，這些突變的種類和頻率常常隨著疾病進展（慢性肝炎-肝硬化-HCC）逐步累積，可用於預測肝硬化和HCC的發生和發展[22]。我們的回顧性和前瞻性隊列研究結果均顯示，HBV突變組合（C1653T、A1762T / G1764A和T1753V）對HCC的發生有良好的預測價值[23]。但是，這些HBV突變在增強病毒致癌能力的同時，也削弱了其感染能力。在HBV的母嬰傳播過程中，在母體突變型和野生型HBV均存在的前提下，野生型HBV而不是突變型HBV在感染新生兒肝臟細胞中具有絕對優勢[24]。由此可見，每次新感染都是以野生型為主，而HCC相關變異型HBV是在人體內感染後加速進化的產物，能夠適應體內的免疫選擇壓力，但是其感染能力較弱，不易在宿主之間傳播，會伴隨宿主的死亡而消亡，屬於"沒有出路"的病毒進化，我們稱之為"末路進化" （dead-end evolution）[25]。

HCC相關HBV突變也嚴格遵守"變異－選擇－適應"的達爾文進化規律。大多數HBV突變是隨機的，但是在慢性炎症微環境的免疫選擇壓力下，HBV的隨機突變也有了確定的方向。在"炎症-免疫"微環境作用下，突變型HBV大多數被免疫反應所清除，但少數可以促進肝細胞增生的HBV可能存活下來，並逐漸發展為適應炎症微環境的促HCC發生和發展的變異型HBV。慢性感染初期、免疫耐受階段的免疫壓力較弱，大多數HBV是野生型。隨著慢性感染的持續，逐漸增強的免疫壓力增加了病毒突變的發生頻率[26]。大多數HCC相關的HBV突變產生於HCC之前，因此，HCC相關HBV突變可以作為預測HCC的標誌物[23]。STAT3、核因子-κB、人類白細胞抗原-DP和-DQ等炎症信號通路相關基因的SNP可維持慢性炎症，加速HCC相關HBV的選擇作用，增加肝細胞癌的風險[27]。

四、肝細胞與HBV的共同進化

隊列研究結果顯示，HBV的致癌突變發生在HCC發生之前[23]。因此，HBV的進化主要可歸因於其慢性感染過程中誘導產生的慢性非可控性炎症微環境的選擇作用，而HBV進化產物——攜帶HCC相關突變的HBV反過來可以作用於肝細胞，促進其向HCC方向的進化。研究結果顯示，帶有A1762T / G1764A雙突變的HBx基因片段和全長HBV基因轉染人肝細胞和HCC細胞後，可以誘導腫瘤抑制蛋白p21的降解，上調S期激酶相關蛋白2的表達，進而增強細胞的增殖和轉移能力[28]。同樣，HBV preS和S區域的突變也有顯著的促癌作用。攜帶有F141L突變的HBV大S片段（preS1/preS2/S）可以同時下調p53和p21的表達，並上調細胞周期蛋白依賴的激酶4和細胞周期蛋白A的表達，顯著促進肝細胞增殖。轉染F141L突變大S片段的肝細胞克隆形成率大約為轉染野生型大S片段肝細胞的2倍[29]。眾多前瞻性流行病學研究結果顯示，感染突變HBV的慢性感染患者更有可能發展為HCC[23,30]。此外，HBV突變可以直接和間接地參與宿主基因組的改變。首先，攜帶HCC相關突變的病毒DNA片段可以直接整合到人類基因組中而引起體細胞突變。羧基端截短的HBx是病毒整合的主要形式，與全長HBx整合相比，它有更強的致癌作用[31]。

肝細胞與HBV的共同進化現象，一方面可以用於HCC的早期診斷，依靠相對來講易於檢測的HBV突變情況即可了解HCC的進化階段，做出早期診斷並採取相應預防治療措施；另一方面可以用於對HCC進化各階段的干預，即深入研究突變型HBV的具體致癌機制有望闡明HCC進化的具體機制，在HCC針對性預防和個體化治療、降低發病率和病死率方面具有重要的現實意義。

參考文獻（略）

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