重磅！JNCI在線發表研究論文：circRNA翻譯具有重要生物學功能的蛋白質
2017年8月29日，中山大學附屬第一醫院神經外科張弩副教授團隊在國際頂級學術期刊美國國家癌症研究所雜誌JNCI（Journal of the National Cancer Institute，IF 2016=12.589）發表題為「Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis」的研究性論文，在國際上首次證實circRNA circ-FBXW7可以翻譯一種抑制膠質瘤的全新蛋白質。circ-FBXW7翻譯的蛋白FBXW7-185aa可以協同母基因編碼的FBXW7蛋白調控原癌基因c-Myc蛋白的穩定性，抑制惡性膠質瘤的發生進展。此部分研究是在國際上首次報道circRNA翻譯的蛋白質可以協同母基因翻譯的蛋白質發揮生物學作用。本研究再次打破了科學界以往將circRNA看作「非編碼RNA」的傳統認識，進一步拓展了circRNA的研究領域。
這也是2017年3月後 Cell research、Molecular Cell等雜誌報道circRNA可以翻譯蛋白質的又一篇在腫瘤學研究中的重量級的報道。山人認為該文相比之前的研究最大的突破在於發現circRNA可以翻譯功能性蛋白並證明了產生的新蛋白的分子機制，新意突出，意義非凡！大家看到這篇文章的時候可能也會思考幾個問題：作者怎樣鎖定本研究中的目標分子？怎麼證實circRNA翻譯蛋白質？如何研究circRNA翻譯蛋白質的生物學機制？下面就讓我們通過拜讀這篇大作，一起學習下吧。
1. 如何鎖定要研究的目標circRNA分子？
首先作者通過對腦膠質瘤臨床組織標本進行circRNA深度測序及生物信息學分析挖掘，發現了一些在腦組織以及癌旁組織中有明顯表達差異的circRNA，研究者關注了著名的抑癌基因 FBXW7 基因的第 3、4 外顯子環化後形成一個 620nt的環狀 RNA，作者將此circRNA命名為circ-FBXW7。通過PCR、sanger測序、northern blot、FISH等常規實驗技術手段證實了circ-FBXW7在組織中的表達情況及大小和亞細胞定位。作者發現circ-FBXW7真實的大小長度是620nt，而不是circbase資料庫中提交報道的1227nt。山人抱著驚訝的心態去cicbase資料庫中去檢索了一下，發現目前circbase資料庫中還是收錄的序列長度為1227nt，這是什麼原因呢？按照本研究的報道發現circ-FBXW7 跨越的基因組長度是1227bp，但是中間有一段不保守的內含子被剪接掉了，山人回想起來之前來自北京生科所的趙方慶研究員報道的發現circRNA內部存在可變剪接，是不是這個原因導致的circbase收錄的序列長度有錯誤呢？山人又到來自南京航空航天大學宋曉峰教授構建的circRNADb在線資料庫檢索了一下，發現此資料庫收錄了FBXW7基因對應的一個circRNA跨越基因組長度1227bp的分子，剪接的成熟體circRNA是620nt，和本研究報道的吻合。 通過這一細節，山人發現作者研究團隊前期研究做的非常嚴格，沒有盲目相信circbase中提交的序列，而是通過了自己的實驗確定了circRNA circ-FBXW7成熟體真實長度，可見好的開始是成功的一半。這也給廣大circRNA研究者提供的一個思路，一定要用嚴格的實驗證實目標分子大小。
圖1,2 circRNA高通量測序以及 circ-FBXW7 識別鑒定（來自參考[1]）
2 怎麼證實circRNA翻譯蛋白質？
作者進一步研究發現在circ-FBXW7中存在高度保守的內部核糖體插入位點序列（IRES），並用雙熒光素酶系統證明了其活性。IRES後存在一個跨越環狀接點的開放讀碼框（編碼185個氨基酸）。作者通過構建circRNA系列表達載體以及製備特異性檢測circRNA翻譯蛋白的抗體並且結合質譜檢測的手段，證實了circ-FBXW7 RNA 翻譯了一個大約21KD的蛋白質，將其命名為FBXW7-185aa。circ-FBXW7環化後形成的開放閱讀框跨越環化位點多翻譯18個氨基酸，這18個氨基酸是在目前的已知蛋白質資料庫中沒有收錄的，因此作者針對此18個氨基酸製備特異性抗體。回憶起之前發表在cell research和Molecular Cell的論文均沒有抗體檢測內源性circRNA翻譯蛋白的直接證據，相比之下，本文以抗體和質譜證實了內源性蛋白的客觀存在，也是一大亮點！
圖3 circ-FBXW7翻譯蛋白質（來自參考[1]）
3 證明circRNA翻譯蛋白質有生物學功能
故事到此已經很明朗了，作者發現circRNA circ-FBXW7在膠質瘤中表達降低，而且翻譯了一個蛋白質，那麼自然就想到了circRNA翻譯的蛋白質有沒有生物學功能。通過常規的細胞功能學實驗作者發現circ-FBXW7翻譯的蛋白質可以很明顯抑制腫瘤細胞的增殖。本章節作者使用環狀過表達RNA載體，設置了一個嚴謹的對照組：把IRES序列突變掉，原因是IRES序列突變後，circRNA可以形成但是翻譯蛋白質就受到很大影響，證實是蛋白質發揮了作用，而不是RNA。山人此刻也回憶起來教科書上寫的「蛋白質往往是生命活動的最終體現者」，可見教科書上的東西還是經得起驗證的！
圖4 circ-FBXW7翻譯蛋白質可以抑制腦腫瘤增殖（來自參考[1]）
4 circRNA翻譯蛋白質作用分子機制
本章節是研究的又一個大的亮點部分，如果只發現一個circRNA翻譯了蛋白質，有生物學功能等很難發表在頂級期刊上。作者後續進一步證實了FBXW7-185aa協同母基因FBXW7產生的蛋白一起調控原癌基因c-Myc的穩定性。故事到底是怎麼樣的呢？研究報道FBXW7基因作為一個E3泛素連接酶，可以通過泛素化途徑調控一大批癌基因的穩定性，其中就包括了著名的原癌基因c-Myc。作者首先證明circRNA翻譯的小蛋白FBXW7-185aa 也能明顯降低c-Myc蛋白的表達，並證明FBXW7-185aa影響c-Myc的半衰期。到此作者想到circRNA翻譯的小蛋白是不是和大蛋白作用上有關聯，可能通過查閱文獻，發現了一個重大線索：去泛素化酶USP28是可以提高c-Myc蛋白質穩定性。FBXW7a降低c-Myc蛋白質穩定性，USP28結合FBXW7a N端序列從而抑制FBXW7a對c-Myc的降解。作者推測是否FBXW7-185aa蛋白也可以結合USP28從而促進c-Myc蛋白的降解呢？通過IP及pulldown實驗證實，circRNA circ-FBXW7翻譯的小蛋白質可以競爭性的結合USP28，從而促進全長蛋白FBXW7a對c-Myc蛋白的泛素化降解。難道細胞也懂得「打仗親兄弟，上陣父子兵」道理？
圖5 circ-FBXW7翻譯蛋白質的作用分子機制（來自參考[1]）
5 circRNA翻譯蛋白質臨床意義及動物實驗
基於上述的研究發現，研究者最後又對臨床腦膠質瘤標本進行檢測，統計臨床關聯性。做了膠質瘤細胞的小鼠腦部原位成瘤實驗，結論就是：人類細胞中circRNA circ-FBXW7可以翻譯一個新的蛋白，對膠質瘤有抑制作用並與膠質瘤患者的臨床預後有關聯性。
圖6 環狀circ-FBXW7翻譯蛋白質臨床意義及動物實驗（來自參考[1]）
6 關於本文為什麼可以發表在JNCI雜誌上的幾點思考：
（1）作者在第一步選擇分子的時候就做了嚴格驗證，通過嚴謹的實驗證實了客觀存在的circRNA的成熟體序列。另外山人認為作者選擇的分子非常漂亮，根據資料庫及測序信息選擇了一個表達丰度非常高的分子做研究對象，而且母本基因是一個非常明星的分子-FBXW7。
（2）課題新穎性足夠大。本來能證明circRNA翻譯蛋白質已經比較新穎，作者又拿出以往研究沒有的證據，證明內源性circRNA翻譯蛋白質的存在；另外分子機制明確，將原癌基因c-Myc作為切入點也是本研究的一大亮點。
最後，本文毫無疑問將是2017年度circRNA在腫瘤研究領域的重大進展之一。本研究也是山人看到的第一個circRNA翻譯的蛋白質在腫瘤學領域有重大意義的報道。circRNA不是像往常認為的那樣不能翻譯蛋白質，而是可以翻譯有重要生物學功能的蛋白質！山人期待未來有更多更有趣的circRNA相關研究工作發表出來。
參考文獻：
1. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis
Yibing Yang Xinya Gao Maolei Zhang Sheng Yan Chengjun Sun Feizhe XiaoNunu Huang Xuesong Yang Kun Zhao Huangkai Zhou ...?Show more
JNCI: Journal of the National Cancer Institute, Volume 110, Issue 3, 1 March 2018, djx166,
https://doi.org/10.1093/jnci/djx166
Published:29 August 2017
TAG:circRNA |