CRISPR基因療法亮劍，逆轉心臟遺傳病進程——專訪上海中山醫院心內科顏彥教授

葯明康德/報道

1986年，一個橫跨大西洋兩岸的法國-加拿大家系走入了心臟病學研究者的視野。渥太華大學心臟研究所Martin S. Green教授攜手斯坦福大學遺傳學系J. Michael Cherry教授，通過對該家系整整五代人中所有患病者的樣本分析，首次發現某些家族性心室預激綜合征（Wolff-Parkinson-White Syndrome）為基因突變引起，且患者會出現室上性心律失常和心肌肥大等癥狀。2002年，加拿大University Health Network研究員Michael Gollob博士，首次在分子遺傳學層面鎖定了一種基因突變類心室預激綜合征的「元兇」：通過對多個家系患者基因測序，證實他們的染色體都存在PRKAG2突變。雖然這些研究成果來自北美學者，而心室預激綜合征卻是中國70%陣發性室上心動過速患者的疾病誘因。

加拿大University Health Network研究員Michael Gollob博士

然而儘管PRKAG2心臟疾病的病因已確認十餘年，卻一直缺乏有效的治療手段。依靠多年的臨床實踐經驗和開拓創新的研究精神，上海中山醫院心內科主任醫師顏彥研究組攜手武漢大學生命科學學院院長宋保亮研究組，在小鼠模型上利用CRISPR/Cas9基因治療策略成功逆轉了PRKAG2心臟疾病的主要指標。這不僅是PRKAG2基因突變患者的福音，更是人類首次運用CRISPR基因療法治顯性遺傳心臟疾病，為心臟病診療方向帶來了新的希望和曙光，相關研究成果也於去年在線發表在《細胞》子刊《Cell Research》之上。

顏彥在上海醫科大學獲得碩士、博士學位之後，在美國克利夫蘭心臟中心完成博士後訓練後回國，在冠心病內科保守及介入治療以及心肌病等領域有多篇重要論文發表，於2011年獲得葯明康德生命化學研究獎，並曾榮獲衛生部科技進步二等獎。

上海中山醫院心內科主任醫師顏彥教授

基因剪刀手：逆轉心肌糖原異常沉積之路

葯明康德：請問您是通過怎樣的契機投身於PRKAG2基因突變型心臟疾病的療法研究？作為心臟預激綜合征範疇內的一種遺傳病分支，該疾病有哪些獨特的癥狀和病理特點？

顏彥教授：幾年前來自浙江諸暨的一對母子來到中山醫院看病，他們都是PRKAG2基因突變患者。雖然經過多種治療方式的嘗試，這對母子最終仍然不幸離世。基因突變先天性代謝疾病的致死致殘很高，面對病人的痛苦和現有醫療手段的匱乏，臨床醫生常常感覺到無奈；但正是醫學的局限深深觸動了我，並激勵我們利用最新的科技手段實現臨床治療的突破與創新。

PRKAG2心臟綜合征是一種常染色體顯性遺傳性疾病，PRKAG2基因編碼單磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）γ2亞基。AMPK 即單磷酸腺苷（AMP）激酶，被譽為「細胞能量調節器」，它既有短期的能量代謝調節作用，也有長期的基因轉錄調節作用。AMPK的亞單位幾乎可以在所有代謝器官內表達，雖然目前人類對其龐雜生理作用的研究還在初始階段，但該激酶已經成為糖尿病、肥胖等多種代謝疾病療法研究的重要靶點。

AMPK龐雜的生理功能（圖片來源：wikispaces.com）

PRKAG2心臟綜合征主要是因為AMPK活性紊亂導致心肌糖原異常沉積，從而引起心肌肥厚、心室預激、進展性傳導系統疾病，甚至可能誘發心源性猝死。心肌細胞的不斷病變如果不能有效逆轉，可能發展為心臟衰竭，並需要進行心臟移植。

葯明康德：請您介紹一下該基因療法的實驗細節和治療理念。

顏彥教授：我們從患病家系者體內檢測到AMPKγ2亞基上存在H530R突變，並以此構建了表達該突變基因的轉基因小鼠和基因敲入小鼠模型。兩種小鼠模型均成功再現了病人的主要病理特徵，首次在實驗層面證實H530R突變為PRKAG2心臟綜合徵發生的關鍵蛋白結構域位點。

CRISPR/Cas9作用示意圖（圖片來源：顏彥課題組）

之後我們將CRISPR/Cas9裝載在安全高效的腺相關病毒9 （AAV9）中，並遞送到小鼠心臟表達。腺相關病毒是依賴腺病毒而生的一種單鏈DNA亞病毒，其安全性好、宿主細胞範圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長，所以被視為最有前途的基因轉染載體之一，目前已經常用於基因療法和疫苗研究。

AAV9-CRISPR注射後的H530R突變小鼠心臟大小恢復正常（圖片來源：顏彥課題組）

在實驗中，AAV9-CRISPR注射後的小鼠實現了特異性等位基因編輯，實驗結果顯示H530R突變小鼠的心臟大小恢復正常。儘管成年人的心臟細胞不能像幹細胞基因一樣被徹底重新編程，但是該實驗還是抑制甚至阻斷了心肌糖原在細胞的不斷沉積，以及由此引發的結構功能障礙，從而逆轉了相關心臟疾病的主要指征。

懸壺濟世，渴望實現本土突破性研究貢獻

葯明康德：臨床醫生兼顧門診治療與學術研究是非常艱巨的挑戰。您如何看待臨床醫生投身全新療法探索與新葯研發所面臨的挑戰？

顏彥教授：中國是一個人口大國，心血管疾病患病人群數量也非常龐大，然而心內科領域的疾病研究以及療法創新，至今仍然幾乎被歐美及日本醫學家、學者壟斷，比如中國70%陣發性室上心動過速的患者都受累於心室預激綜合征，但是與PRKAG2相關的學術研究最初仍是由北美學者主導。

這樣的例子還有很多，比如唯一的天然水溶性降血脂他汀類藥物——普伐他汀（Pravastatin）由日本第一三共研發成功後上市。該藥物與脂溶性他汀類藥物最大的區別，在於高度的肝臟選擇性，避免了對肝外組織的不利影響。在該藥物成功研發之前，也有歐洲研究人員對同類先導化合物進行過檢測，認為不能確認其降低膽固醇作用；而日本研究者則矢志不移地尋找突破口，在無數次小鼠實驗失敗之後，最終經過整整6000次實驗發現了其在小狗身體內的降低膽固醇作用。

普伐他汀化學分子式（圖片來源：維基百科）

相較於研究所的學者，臨床醫生開展學術研究面臨著不同的挑戰，的確受限於門診量、工作環境、實驗條件等客觀因素。但我認為所有學術成果得以實現的關鍵，是嚴謹的治學態度和敢於懷疑的學術精神。發達國家醫生的日常工作量也很大，但他們仍然能克服挑戰並取得很多突破，無疑是激勵我前行的榜樣。不論在心內科還是胸外科，作為臨床醫生如果只是跟風國外成果，那麼我們畢生的工作對於整個醫學界的進步而言都是微不足道的。如今國家的整體經濟和科技水平進展迅猛，我非常希望能夠在自己的研究領域做出一些根本性的研究貢獻。

葯明康德：除了在疾病藥物靶點發現以及新型療法突破之外，您認為還有哪些領域也是心內科疾病診療的發展方向？

顏彥教授：患者在接受治療之前，首先需要醫生的診斷、選擇治療手段、制定綜合方案，這些才是最關鍵的環節。當代尖端的診斷檢測儀器設備層出不窮，所以有些人會放鬆對基礎醫學知識的積累，更忽略了對於病人心理和生理狀態的綜合判斷。什麼是醫學甚至生命科學的本來面目呢？19世紀美國著名結核病醫生Edward Livingston Trudeau留下了醫學界的至理名言：有時去治癒，常常去幫助，總是去安慰。其實基礎知識仍然是我們斷症的基本功，創傷性的檢測手段甚至手術方式應該作為輔助，來幫助我們進行診療。對於一些重大疾病、疑難雜症、危重病人的病例，醫生更應該切實更應該考慮病人的心理、年齡、家庭等情況，做出合理的確診結論和治療方案，避免誤診和過度治療。

Edward Livingston Trudeau生前影像

近期有一個30出頭的年輕小夥子從無錫轉院到中山醫院，之前的結論是心衰且必須立刻進行心臟移植。但是我通過綜合判斷確診他只是主動脈瓣反流引起一系列癥狀，所以這位病人通過瓣膜手術之後很快痊癒出院。如果當時這個年輕人接受了誤診並等待器官移植，這對於他的手術風險以及今後的人生質量，都會帶來不可估量的負面效果。

十多年前我還遇到一位寧波患者，患有右心房惡性淋巴瘤卻被誤診為心內膜炎。這位患者最初因為診斷為竇房阻滯而植入永久起搏器，之後出現高熱又被診斷為心內膜炎；她轉入中山醫院之後立刻施行全麻永久起搏器取出，在這個過程中發現了非霍奇金性惡性淋巴瘤。原發心臟惡性腫瘤極其罕見，但是如果通過臨床經驗的積累，在遇到不明原因的發燒、心衰、心肌肥大、心包積液以及上腔靜脈綜合征，仍應考慮惡性腫瘤的可能性。這個案例更說明基礎知識的積累和更新永遠不過時，先進的儀器並不一定能超越紮實的基本功。

理想與方向：讓天下沒有難治的病

葯明康德：多年的臨床診療生涯中，您覺得自己能積累紮實的基本功、並準確診斷疑難雜症，關鍵的秘訣是什麼？

顏彥教授：我於1992年開始攻讀上醫大的研究生課程，那個年代學風單純正統，相對而言各種干擾誘惑都比較少。我們求學的理想就是要全面學習心臟病學的基礎知識，成為一個懷有優秀臨床技能的醫生。當時的導師如今已經是耄耋之年，仍然勤奮學習研究，所以當年他對我們的影響非常大。我至今仍然忘不了學生時代每天和導師查房看診的日子，特別努力記憶所有的醫案和病人病例、既往病史，希望能夠準確全面地回答導師提問，並進行團隊合作救助病人。

顏彥教授參加2011年葯明康德生命化學獎儀式

許多疾病都相互關聯，需要醫生從病人的整體身體情況來把握判斷，只見樹木不見森林是醫生的大忌，這就需要醫生從學生時代開始要有良好的基本功。生命科學的進展一日千里，我們要不斷夯實自己的知識儲備才能最終為病人提供優質服務。所以從立志於投身臨床醫療這個行業開始，白天看病晚上學習，雖然知識和經驗的積累很辛苦繁雜，但我從來不敢荒廢一天！優質服務不只是喊口號，而是要真刀真槍，拿出真本事。

葯明康德：對於未來的行醫和學術研究，哪些人是您追隨的榜樣？您還有哪些努力方向？

顏彥教授：除了學校和醫院的前輩專家，我還很喜歡從心臟病治療的歷史中尋找榜樣的力量。我喜歡了解心臟病發展和醫學發展的歷史，在每一個重要節點對醫學做出重要貢獻的人物都讓我欽佩。

18世紀末正式成功推廣牛痘預防天花的英國醫生Edward Jenner被譽為免疫學之父，他因此被稱作史上救人最多的醫生。但同時他在心血管領域也做出了重大的貢獻，這一點卻並不為人熟知。當時有一位外科醫生罹患心臟病去世之後由他解剖，Edward Jenner細緻地觀察到了冠狀動脈阻塞會引起心絞痛的生理結構。

Eugene Braunwald原先是來自奧地利的猶太人，在二戰期間前往美國。他引領的團隊所做出的貢獻影響了心血管疾病治療整整半個世紀的發展歷程，而他主編的《心臟病學》和《哈里森內科學》也成為全世界心血管醫生的聖經。他很多學術理念和人生哲學都深深地影響著我，我希望自己能從這些泰斗級大師的身上汲取正面的力量。

Eugene Braunwald教授

談到對於未來的研究展望，其實我這樣年資的醫生對於很多常見病甚至疑難病都能做出很好的診斷。但正如我之前所言，不少心臟疾病仍卻缺乏有效治療手段，而臨床醫生要進行創新療法研究也面臨著許多軟硬體的挑戰。像葯明康德這樣的一體化研發服務平台對於我們而言非常重要，我相信今後通過更加豐富的產學研聯合模式，可以更好地將研究平台與醫療需求結合在一起，為廣大患者做出更大的貢獻和幫助。讓天下沒有難治的病，難做的葯，是個宏偉的目標，也是讓我真心感動的理想，希望我們共同努力朝這個方向努力前進！

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