真的搞錯了嗎？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解讀

BioArt按：最近一段時間，圍繞m6A修飾的相關研究有種讓人應接不暇的感覺，而且對於催化、去除和識別m6A的酶或者蛋白基本上學術界已經有一個統一的定論了。然而前不久，康奈爾大學醫學院的Samie R. Jaffrey課題組在Nature上發表一篇長文，文章賦予了m6A甲基化修飾酶FTO新的重要催化功能，並且暗示FTO事實上更多的酶活是催化m6Am而不是m6A去甲基化。當然，如果Samie課題組的這一結論是對的話，那麼過去圍繞FTO酶活的研究就會受到嚴重的質疑，然是事情究竟是怎樣呢？為此，BioArt特別刊登了北京大學化學與分子工程學院的博士生段洪超關於上述問題的詳細解讀，將有助於讀者朋友更深入地了解科學研究的真諦所在。

撰文 段洪超（北京大學化學與分子工程學院博士生）

m6A，還有它背後的RNA表觀遺傳學/表觀轉錄組學，已經是一座名副其實的金礦了。淘金越來越火熱，大佬們各說各話，各種研究結果也是鋪天蓋地的。聲音的來源多當然是好事啦，說明這是個方興未艾的「活」領域，對於在這個大坑裡撲騰的小弱，最好的消息肯定是發的文章引用次數必然「咔咔」地漲，也就不用愁沒有雜誌接收了。不過，如此龐雜的研究結果，其中甚至還有相矛盾的結論，怎樣摸清脈絡、把握方向、去偽存真，還真得多下些工夫。筆者說來也在這個領域做過蠻長時間了，這裡就和大家講一些其中的小trick。

就拿FTO在體內的作用底物這件事來說吧。今年年初，康奈爾大學的Samie Jaffrey教授搞了個大新聞，他在一篇Nature文章上報道稱，mRNA上5』cap區域的m6Am修飾是可逆的，並且調控了mRNA的穩定性和翻譯效率【1】。和m6A一樣，m6Am也是在上個世紀70年代就被發現的mRNA修飾，然而這麼多年來，它的功能一直是個謎，甚至連它是怎麼來的（甲基轉移酶）都不知道。本來嘛，發現了一個新的RNA修飾的功能，小弱們只要在後面緊跟一波就行了，沒成想定睛一看，竟發現m6Am修飾的去甲基酶是FTO，而且FTO對m6Am的酶活還比m6A要強很多，作者還在文章中暗示，m6Am才是FTO在體內真正的底物。

筆者當時被hè了一跳，RNA表觀遺傳學的開山之作被人推翻了？話說FTO是最早通過全基因組關聯分析找到的肥胖相關基因，自發現伊始就被各方關注（這可都是NIH的小錢錢啊），可是它到底是幹嘛使的卻在很長一段時間內不為人所知。2011年，何川教授實驗室最先確定了FTO的作用底物是mRNA上的m6A，而這也是第一個被發現的可逆RNA修飾【2】，RNA表觀遺傳學/表觀轉錄組學的研究由此肇始。賈桂芳博士和付曄博士的這篇Nature Chemical Biology也真不是蓋的，6年560次引用。隨後在2013年，他們二人進一步探究了FTO對m6A作用的詳細機理【3】，FTO將m6A依次氧化為hm6A、f6A，這兩個中間產物不穩定，分別脫除一分子甲醛和甲酸轉變為正常的A，FTO對m6A的去甲基作用算是坐實了。現在突然有人告訴筆者，FTO的作用底物不是m6A？趕緊讓我喝一口82年的蒸餾水壓壓驚。

圖1 m6A和m6Am

m6A和m6Am的差別僅在於核糖2』-O上的甲基修飾（圖1），從化學的角度看，其實它們是很相似的。而FTO所作用的都是N-6位的甲基修飾，想來它也不會太過「厚此薄彼」。在大坑裡撲騰久了，有件事必須瞭然於胸，越是勁爆的文章，就越要留心它的實驗是怎麼做的，數據是怎麼處理的，這些數據到底能不能支持它的結論。所以筆者把Samie Jaffrey教授的這篇文章連同擴展數據、支撐材料都仔細扣了一遍，果然發現了一些不大對勁的地方。

Samie文章里稱得上實錘的證據大抵上有這麼兩點，首先最直接的，FTO的敲除和過表達沒有顯著影響細胞內m6A修飾的水平（圖3）。這個和何川教授2011年的Nature Chemical Biology文章相矛盾。不過筆者發現，這兩篇文章中m6A修飾水平的檢測方法是不同的，而對相關實驗不熟悉的小夥伴，發現這一點似乎還真不容易。

簡單來說，Samie的檢測方法比較糙一些。RNase T1是一種特異性在鹼基G後面切割的RNA酶，利用很多m6A分布在G後面的特點，用RNase T1對待檢測樣品進行消化，並在新暴露出的5』末端加上放射性的32P——這樣一來，包括m6A在內的相當一部分鹼基就被標記了，再將RNA消化為單個的核苷酸，並用二維薄層色譜展開，比照各種核苷酸標準品的展開位置（圖2），就可以計算出某種核苷酸的相對含量了。

圖2 用二維薄層色譜法檢測各種核苷酸的含量

細心的小夥伴可能已經發現，這種方法只能檢測到RNA上位於G後面鹼基中m6A的含量。而事實上，m6A在mRNA上通常出現在RRACH（R表示G或A，H表示A、C、U）的序列模式中，也就是說，m6A不僅位於G的後面，還位於A的後面，但是Samie的方法卻將這部分m6A完全忽略掉了。

圖3 在Samie Jaffrey教授的文章中，過表達和敲低FTO對鹼基G後的m6A含量沒有影響

另一方面，何川教授的文章使用了液相色譜-三重四極桿質譜聯用的方法。這種方法就很直接啦，將待檢測的RNA樣品用酶消化成單個的核苷，經由LC-MS/MS檢測，並比照標準樣品計算出每種核苷的絕對含量。由此，mRNA上所有m6A都可以被檢測到，結果也就更靠譜了。

Samie文章另一個證據呢是FTO對m6Am的酶活比m6A要強100倍（kcat/Km）。不過，筆者文獻看得多，一般人騙不了的。之前多項獨立工作【2,4,5】均報道FTO對m6A的kcat/Km在0.6~0.7 min-1μM-1的範圍內，而Samie Jaffrey教授這篇文章中所測得的數值只有0.06，直接低了10倍，確定這不是在開玩笑？筆者都不禁要懷疑某些同學的實驗能力了，這樣的酶純化、生化反應水平真的過關么？

那這樣看來，從實驗數據的角度，Samie Jaffrey教授的這篇文章確實是有不少問題的，並不能說是推翻了2011年何川教授的文章。不過，這些也只是從已發表數據中發現的一些，如果可以看到相關實驗的第一手數據，事情的脈絡可能會變得更清晰。雖然不從事FTO的研究，筆者還是聯繫的2011年Nature Chemical Biology文章的第一作者，現在在北京大學化學與分子工程學院任職的賈桂芳博士，並拿到了一些相關的數據。

原來，本著科學嚴謹的態度，早在Samie Jaffrey教授的文章發表之初，賈桂芳博士實驗室就在準備相關的實驗，以釐清科學問題的真相。在對Hela細胞和HEK293T細胞敲低FTO之後，用液相色譜-三重四極桿質譜聯用的方法分別檢測m6A和m6Am的變化。結果表明，m6A和m6Am的修飾水平都出現了顯著的升高，以HEK293T細胞為例，敲低FTO，m6A/A升高7.9%，而m6Am/A升高29.7%，但是由於m6Am的含量僅為m6A的十分之一，這樣算下來，FTO作用於m6A的絕對個數是m6Am的2.7倍！

圖4 用LC-MS/MS檢測，FTO在體內既影響了m6A修飾，又影響了m6Am修飾

而後，他們採用了與Samie Jaffrey教授相同的實驗條件，相同量的FTO蛋白用量對相同量的從Hela細胞中提取的mRNA進行了體外去甲基反應，結果看到有75%的m6A去甲基化率，小編好奇如此大的變化，Samie大教授的實驗結果怎麼能顯示去甲基率為零呢！接著賈桂芳博士實驗室進一步降低FTO蛋白用量，在m6Am不被完全去甲基的條件下，可以相對比較FTO對m6A和m6Am的去甲基化效率。雖然表面看FTO對m6A的去甲基率要低於m6Am，但必須注意到一個問題，因為m6A在mRNA上的含量是m6Am的10倍，這樣計算下來，被FTO去甲基的m6A的絕對量還是要顯著地多於m6Am。

圖5 FTO對mRNA上m6A和m6Am的體外酶活實驗

而如果用同樣的標準去考量體內實驗的數據，他們發現，在每1000個鹼基A中，FTO的knock down所影響的m6A數量約為0.2~0.3個，與體外實驗結果相近，而影響的m6Am的數量卻是0.07~0.11個，明顯要低於體外實驗（參見圖4）。有一種可能的解釋，體內的m6Am集中在5』cap區域，而mRNA的5』cap卻被結合蛋白所包圍，它們會阻礙FTO接近m6Am。這樣一來，FTO在體內對m6Am的作用也就大大受限了。

意外地，筆者還了解到，其實早在幾年前，何川教授實驗室的付曄博士就已經發現了FTO對m6Am的去甲基活性，相關內容還可以在付曄博士的畢業論文中查閱到【6】——他正是基於m6A和m6Am的結構相似性預測了FTO同樣可以作用於m6Am，並通過實驗進行了驗證（圖6）。同時，付曄博士也指出，儘管人們還不知道m6Am的甲基轉移酶，但是早年的研究顯示，將Am轉變為m6Am的酶活性主要是在細胞質當中，而FTO卻主要定位在細胞核里，從這個角度考慮，FTO在體內對m6Am的影響究竟有多大，或許還要留一個懸念了。

圖6 付曄博士thesis里（2012年）已報道FTO對m6Am的反應活性

那如果要給Samie Jaffrey教授這篇文章一個中肯的評價，就是發現了一種RNA修飾的生物功能（其實實驗本身還是沿用了何川教授實驗室之前文章的套路），能否稱為某種開山立派的新發現，還是要看隨後的follow-up啦。FTO作為一個m6A去甲基酶，已經被證明在白血病【7】、DNA損傷修復【8】以及熱脅迫應激【9】中起到了關鍵的作用，而它對m6Am的去甲基作用是否會廣泛地調節生命活動，還有待時間的檢驗。我猜至少這是Nature出版集團樂見的。事實上，RNA表觀遺傳學算是為數不多的由華人主導的生物學研究前沿領域了，或許Nature Press想聽到一些不一樣的聲音，而Samie正是他們希望的那種。這些聲音要如何來聽，小夥伴們也要加小心了。

參考文獻

[1] Mauer, J. et al. Reversible methylation of m6Am in the 5 cap controls mRNA stability.Nature541, 371-375, (2017).

[2] Jia, G. et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity associated FTO.Nat Chem Biol7, 885-887, (2011).

[3] Fu, Y. et al. FTO-mediated formation of N6-hydroxymethyladenosine and N6-formyladenosine in mammalian RNA.Nat Commun4, 1798 (2013).

[4] Zhu, C. & Yi, C. Switching Demethylation Activities between AlkB Family RNA/DNA Demethylases through Exchange of Active-Site Residues.Angew Chem53, 3659-3662 (2014).

[5] Zou, S. et al. N6-Methyladenosine: a conformational marker that regulates the substrate 192 specificity of human demethylases FTO and ALKBH5.Scientific reports6, 25677, (2016).

[6] Fu, Y. Dynamic regulation of rna modifications by AlkB family dioxygenases. Ph.D. thesis, The University of Chicago, (2012).

[7] Li, Z. et al. FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase.Cancer Cell31, 127–141 (2017).

[8] Xiang, Y. et al. RNA m6A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response.Nature543, 573–576 (2017).

[9] Zhou, J. et al. Dynamic m6A mRNA methylation directs translational control of heat shock response.Nature526, 591–594 (2015).

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