南海海洋所利用生物合成技術獲得強效抗結核抗生素

怡萊黴素的生物合成基因簇及其生物合成過程。（a）怡萊黴素的生物合成基因簇；（b）怡萊黴素的骨架結構的合成過程；（c）色氨酸的異戊烯基化過程；（d）酪氨酸的硝基化過程；（e）L-2-氨基-4-己烯酸的生物合成機制；（f）怡萊黴素的氧化後修飾過程。

近日，中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，中科院廣州生物醫藥健康研究院呼吸疾病國家重點實驗室，以及廣東醫科大學合作的研究論文，以Biosynthesis of ilamycins featuring unusual building blocks and engineered production of enhanced anti-tuberculosis agents為題發表在Nature Communications上，報道了從深海放線菌中發現了具有抗結核桿菌系列活性物質，通過生物合成技術優化改造獲得低細胞毒活性、強抗結核桿菌活性的化合物怡萊黴素E。

結核病是最為嚴重的傳染性疾病，死亡率已超過HIV，位居傳染性疾病之首。據WHO結核病年報報道，全球2015年新增結核病人1040萬人，其中死亡約180萬人。目前，臨床上應用的4個一線抗結核藥物和8個二線抗結核藥物均是發現於上世紀的40年代到70年代，此後再無新的抗結核藥物出現。直至2012和2014年，FDA和歐盟先後批准貝達喹啉（Bedaquiline）、Delamanid與其他抗結核藥物聯合使用，治療多重耐葯結核桿菌的感染，但存在副作用嚴重且價格昂貴問題，臨床應用受到一定限制。多重耐葯和泛耐葯或全耐葯結核菌株在迅速增長，加上結核病與HIV並發感染等情況的出現，對本已嚴峻的結核病防控形勢帶來了新挑戰，因此對高效低毒的新型抗結核葯的需求日益迫切。

海洋中蘊藏著豐富的海洋微生物資源，其代謝產物尚未被充分發掘利用。深海環境營養匱乏，生活在深海的微生物為了爭奪生存空間，會產生抗生素抑制周邊微生物的生長。研究人員利用這一化學生態學原理從深海微生物中篩選抗菌活性物質。經過篩選，他們發現一株深海（-3560米）來源的放線菌發酵提取物對抗恥垢分枝桿菌具有較強的選擇性抑制活性，並對腫瘤細胞增殖具有一定的抑制活性。研究人員對菌株進行擴大培養和活性追蹤分離，利用多種波譜技術解析了6個命名為怡萊黴素的活性物質結構（圖1，化合物1-6），並用單晶衍射技術測定了3個化合物的絕對構型。怡萊黴素屬於環七肽類化合物，結構中含有獨特的l-2-氨基-4-己烯酸，3-硝基-l-酪氨酸，和異戊烯基化的色氨酸結構單元；其中，l-2-氨基-4-己烯酸結構單元在其它天然產物中未見報道。此外，怡萊黴素結構中的亮氨酸結構單元和異戊烯基均被氧化。

科研人員闡明怡萊黴素的生物合成機制，並利用生物工程技術構建突變株，期望構建新結構衍生物，簡化代謝產物組分，並提高目標組分的產量。科研人員對怡萊黴素產生菌進行了基因組測序，根據怡萊黴素的結構特徵，通過生物信息分析和基因敲除技術，確定了負責怡萊黴素的生物合成基因簇（圖1，a）和骨架結構的生物合成過程（圖1，b）。對四個功能基因進行敲除和代謝產物分析，結合前體分子餵養及同位素標記實驗，闡明了新穎的I型聚酮合酶IlaE、細胞色素P450氧化酶IlaD、氨基轉移酶IlaH和II型硫酯酶IlaF負責稀有結構單元l-2-氨基-4-己烯酸的生物合成（圖1，e）。對怡萊黴素生物合成基因簇中的一氧化氮合酶IlaM和細胞色素P450氧化酶IlaN所編碼的基因進行敲除和代謝產物分析，及前體分子回補實驗，闡明了L-酪氨酸的硝基化過程（圖1，d）。通過對怡萊黴素生物合成基因簇中的異戊烯基轉移酶IlaO和另外兩個細胞色素P450（IlaL和IlaR）所編碼的基因進行敲除，代謝產物分析，以及中間體的分離和結構鑒定，闡明了IlaO在怡萊黴素形成過程中負責色氨酸的異物烯基化的前修飾作用（圖1，c），IlaL和IlaR這兩個酶在怡萊黴素生物合成過程中分別負責亮氨酸末端甲基的羧基化及異物烯基的環氧化的後修飾（圖1，f）。通過上述研究，科研人員發現，怡萊黴素生物合成過程中的三個前修飾和兩個後修飾過程，並構建高產菌株，定向生產新結構衍生物怡萊黴素E和F。

科研人員系統評價了分離和工程改造獲得的系列怡萊黴素衍生物對結核分枝桿菌M. Tuberculosis H37Rv，5種人體腫瘤細胞株和2種正常細胞株的抑制活性，研究發現，怡萊黴素E的體外抗結核活性為9.8 nM，是一線抗結核藥物利福平活性的30倍，怡萊黴素E對乳腺癌等腫瘤細胞也顯示出一定抑制活性，對正常細胞的毒性較低，在抗結核活性和細胞毒性之間的選擇性指數為400-1500，顯示出較好的安全性窗口，具有成藥潛力。該研究闡明了海洋微生物複雜活性代謝產物怡萊黴素的生物合成機制，並獲得具有更好活性和低毒性的抗結核活性化合物，為新型抗結核藥物的進一步開發提供了化學實體。

研究工作得到了國家自然科學基金、中科院、廣東省自然科學基金團隊和廣州市科技計劃項目的資助。

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