MSCs療法-中山大學2016iGEM成果簡介
中山大學2016年iGEM參賽隊伍的基本信息：
iGEM比賽年度：2016年
類別（Kind）：大學生（Collegiate）
組別（Section）：本業生組（Undergraduate）
地區：亞洲
國家：中國
領域/板塊（track）：療法（Therapeutics）
中山大學2016年iGEM參賽隊伍的獲獎情況：
單項獎（Award）：
最佳新集成部件（Best Composite Part）
最佳療法項目（Best Therapeutics Project）
最佳建模提名（Nominated for Best Model）
最佳新集成部件提名（Nominated for Best Composite Part）
最佳療法項目提名（Nominated for Best Therapeutics Project）
獎牌（Medal）：金獎（Golden Medal）
項目名稱：MSCavalry: MSCs of Next Generation
背景
炎症
炎症是多種疾病的基本過程，如IBD，創傷，關節炎等，是損傷組織癒合過程中不可或缺的部分，與增殖和分解同時發生。這是一系列複雜的病原體和免疫系統之間的相互作用，其中趨化因子和細胞因子在溝通中起重要作用。
在炎癥狀態下，所涉及的組織產生各種細胞因子和趨化因子。這些「炎症信使」與靶細胞上的特異性受體結合併刺激產生額外的炎症信號分子，導致血管舒張，而另一些導致免疫細胞從血液遷移到炎症區域。
傳統療法
如果炎症期未成功控制並適當解決，則以瘢痕形成為特徵的過度癒合反應可導致組織纖維化。更嚴重的是，過度的炎症反應將導致促炎細胞因子和抗炎細胞因子的過量產生，演變為致命的細胞因子風暴。目前的治療方法包括抗炎葯和激素，無法取得令人滿意的結果，主要是由於難以靶向炎症性病變以及副作用，包括骨髓抑制，代謝紊亂等。
MSCs療法
令人激動的是，一種非常有效的和鼓舞人心的基於細胞的療法，近年來逐漸發展，特別是MSC（mesenchymal stem cell，間充質幹細胞）療法。
圖1.1.2該圖來自Somoza R A, Correa D, Caplan A I. Roles for mesenchymal stem cells as medicinal signaling cells [J]. Nature Protocols, 2016, 11(1).
從最初的異質群體中，可以通過用與其在體內的作用相關的標記物進行分選或通過在擴增期間用刺激溶液引發它們來獲得特定的亞群體。MSC具有體外分化為中胚層譜系的能力，並且通過用譜系特異性可溶性因子和特定微環境線索補充培養物來實現這種分化。
間充質幹細胞（MSC）是來自多種成體組織的成體多能祖細胞，例如骨髓，脂肪，外周血，牙髓和胎兒，如臍帶血，華通氏膠（Wharton s jelly），胎盤和羊水。它們被定義為可以分化成幾個譜系的細胞：成骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞，並且應該可以貼壁培養。除上述標準外，MSCs是CD34，CD73，CD90和CD105陽性的細胞，CD11b或CD14，CD19或CD79α，CD34，CD45和HLA-DR陰性。
作為成體幹細胞，它們顯示免疫調節，抗氧化，血管保護和抗纖維化特性[2]，這是由於幾種旁分泌因子的分泌和與免疫細胞的相互作用。鑒於這些有益的特點，MSC療法被認為是各種疾病的有效治療方法，其中治療炎症性疾病是MSC臨床應用最有研究和前景的方面之一。
圖1.1.3該圖來自Gazdic M, Volarevic V, Arsenijevic N, et al. Mesenchymal Stem Cells: A Friend or Foe in Immune-Mediated Diseases.[J]. Stem Cell Reviews & Reports, 2015, 11(2):280-287.
MSCs可能阻礙T細胞，B細胞，抗原呈遞細胞（APC）和自然殺傷（NK）細胞介導的免疫應答。可能MSCs教育免疫細胞誘導產生具有耐受性的調節性免疫細胞。這些調節性免疫細胞，例如調節性T細胞（Treg），調節性B細胞（Breg），調節性APC和NK細胞，將聚集以產生適於調節免疫應答的耐受性環境。為此，MSCs使用具有中樞作用的白細胞介素（IL-10）的多種調節途徑。
限制
那麼MSCs如何應用於患者？
在臨床環境中，MSC的兩種施用方法是常用的：直接局部植入與血管內給葯。由於局部植入受有侵入性的限制，死亡風險高，和有局部調控微環境中斷，血管內給葯現在在臨床使用中更受歡迎。
然而，血管內注射的MSC仍然受到批評，由於
·低靶向/定位效率
·在人體中分布不明確
不可避免地阻礙了他們的臨床應用。
現在我們迫切需要升級，我們SYSU-MEDICINE決定設計下一代MSC - MSCavalry的MSC。
MSCavalry -下一代MSC
我們的目標是設計適應各種炎性疾病的一組MSC（homo sapiens）。我們假設MSCs具有定向和特異性地向炎性組織或器官移動的能力。同時，我們也渴望了解血管內施用的MSC的分布情況。因此，我們的設計包括以下部分：
·趨化因子受體
MSCavalry是一系列用各種一致表達的趨化因子受體（CXCR1，CXCR4，CXCR5，CCR2，CCR5，CCR7）優化的MSC，其能夠結合在不同種類的炎性組織或器官中顯著突出的特異性趨化因子。
·標記蛋白質
MSC還配備有幾種標記蛋白的構建啟動子基因：eGFP，dTomato和螢光素酶，實現了準確定位和突出顯示。
·切換開關
此外，具有感應纖維化轉化的切換開關，轉移到肌成纖維細胞的MSC將因此表達目的基因。
·動物模型
為了證明我們的設計，為未來臨床實驗奠定基礎，我們構建了兩種流行性炎性疾病的小鼠模型：炎性腸病（IBD）和延遲型超敏反應（DTH）。
·轉染
在證實實驗階段，考慮到幹細胞轉染的難度和我們系統體積，我們選擇慢病毒表達載體將我們的系統轉移到MSC中，因為其高轉染效率和能力。然而，鑒於慢病毒的致癌性風險，在未來的研究中我們將使用電轉化方式來轉移我們的系統。
詳細設計
為了投資具有較高定位效率的MSC，並定量局部炎症組織中的MSC，我們構建了一個由兩個基本元素構成的框架，負責感染和定位到炎症部位，並在體內和體外標記MSC。
圖1.2.1我們的第一個設計包括趨化因子受體的基因和構建型啟動子EF-1α下的一組標記蛋白。
·趨化因子受體
趨化因子是控制免疫細胞遷移和定位的信號分子，這對所有免疫細胞運動至關重要，從免疫細胞發育和體內平衡所需的遷移，到產生原發性和遺忘性細胞和體液免疫應答的需要，到用於疾病中免疫細胞的病理性聚集。
在炎症的情況下，其特徵在於效應細胞與炎性部位協同運動的複雜過程，以及免疫細胞從周圍部位到排出淋巴器官的排出需要趨化因子及其各自受體在靶細胞上的表達。
趨化因子受體是與趨化因子結合併啟動細胞遷移的跨膜蛋白。
圖1.2.2趨化因子受體是與G蛋白偶聯的7-跨膜結構蛋白。在與其特異性趨化因子配體相互作用後，趨化因子受體觸發細胞內鈣（Ca2 +）離子中的通量，其導致細胞反應，包括將細胞運送到所需位置的趨化性。
大約有20個信號趨化因子受體負責各種免疫細胞的遷移。這是趨化因子及其相應趨化因子受體的表格。
綜合閱讀後，我們注意到，在不同的炎症部位或病情（急性或慢性）主要趨化因子也不同，我們總結了主要趨化因子以及各種炎性疾病中相應的趨化因子受體。
對於MSCs，當注入動物模型的傷害時，他們能夠優先遷移或停靠在受傷部位，並且該性質可以歸因於MSC的表面上的生長因子，趨化因子受體和細胞外基質受體的表達。趨化性測定顯示培養的MSC遷移到不同的生長因子和促炎細胞因子，這表明化學吸引將系統性輸注的MSC引導到炎性部位。然而，已知培養物擴增的MSC表達低水平的趨化因子受體，其負責引起遷移至炎症區域的白細胞和造血幹細胞的定位。以前的研究已經證明，在培養基中由額外的炎性細胞因子和趨化因子刺激的MSC表達更多的趨化因子受體並顯示更高的靶向效率。
鑒於上述事實，我們旨在通過引入各種趨化因子受體並構建趨化因子受體的不同質粒來調整MSCs以靶向不同疾病的炎症組織：
在我們的實驗中，我們選擇炎症性腸病（IBD）模型，CXCL12變化最明顯，其相應的受體是CXCR4和延遲型超敏反應（DTH），其中CXCL13（與CXCR5的相應受體）變化最為顯著，以證明我們的設計。我們設計趨化因子受體在構建型啟動子EF-1α的控制下表達，因此它們可以一直由MSC表達。
為了選擇兩種動物模型的特異性趨化因子受體，通過qPCR分別測定DTH和IBD中各種趨化因子的表達水平。如圖所示，CXCL12（CXCR4作為相應的趨化因子受體）在IBD中佔優勢，而CXCL13（CXCR5的配體）在DTH中最顯著增加。
·標記系統
為了證明其概念，我們在同一啟動子下添加趨化因子受體後的eGFP / dTomato和Renilla-Luciferase 2-單加氧酶（Rluc），以說明體內和體外注射後MSC的分布。與前一部件相比，BBa_K1071009，我們的新部件，BBa_K1993008，改進了熒光素酶的體內追蹤功能，實現修改細胞的雙重定位功能。
圖1.2.11 BBa_K1993008
對於體外觀察，我們選擇eGFP / dTomato，在熒光顯微鏡下可見的常用熒光蛋白。
對於MSCs分布的體內監測，我們選擇熒光素酶氧化熒光素，因此通過IVIS Spectrum可以在活體動物中觀察到MSC。
·切換
MSC的移植成功，生存，表型和活動強烈依賴於在遞送部位呈現的微環境。這種微環境通常具有癒合傷口的特徵，包括炎性細胞，新血管系統和前纖維化細胞因子如TGF-β。組織修復和腫瘤微環境可能將MSC轉化為收縮性肌成纖維細胞（MF），其形成α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的應激纖維，導致纖維增生和降低克隆生成和成脂潛能。
MSCs中α-SMA的qPCR。在炎癥狀態下檢測到α-SMA的mRNA高度正常，α-SMA mRNA無法檢測到。在免疫熒光方面，在對照組不可觀察到的TGF-β處理的MSC中可觀察到熒光。
通過連接eGFP，BBa_K1993014的α-SMA（pSMA）啟動子，我們能夠通過觀察條件表達的eGFP來檢測分化的MSC
為了證明切換的功能，我們設計了部分BBa_K1993014，pSMA啟動eGFP的表達。如果在對照組的非表達對比中，在TGF-β（炎症模擬）的刺激下觀察到eGFP，則該轉換將被證明是有效的。
·體外證明
我們決定在三個層面上證明我們的系統：MSCs是否保持表型，我們的系統是否按預期表達，以及是否具有趨化因子受體的MSC表現出較高的趨化能力。
表形
如上所述，MSC能夠分化成三個譜系：成骨細胞，軟骨細胞和脂肪細胞，這是MSC最重要的標準之一。因此，我們決定證實是否能夠誘導工程化的MSC分化成這三個譜系，並應用流式細胞術來評估特異性表面分子的表達水平。
系統的表達
對於我們系統的表達水平的檢查，qPCR應用於趨化因子受體，而eGFP / dTomato在熒光顯微鏡下觀察。
趨化性測定
我們使用transwell來識別趨化性。當放置在多孔組織培養板的孔中時，塑料插入物產生兩室系統。通過將細胞置於上部細胞和下部的趨化因子，通過計數從過濾器下側遷移通過過濾器孔的細胞來確定趨化性。
·體內證明
為了證明我們的設計並為未來的臨床實驗奠定基礎，我們構建了兩種常見的炎性疾病：炎症性腸病（IBD）和延遲型超敏反應（DTH）的小鼠模型。
IBD
包括克羅恩病（CD）和潰瘍性結腸炎（UC）在內的炎症性腸病由多種因素引起，如遺傳易感性，粘膜免疫耐受分解，腸道微生物群的自身免疫激活。目前的治療方法主要是為了抑制明顯的炎症，包括使用藥理學，生物學和手術去除發炎腸段。然而，這些治療方式由於非附著性和複發而具有局限性。在過去十年中，在臨床試驗中已經對IBD的腔內和瘺形式進行了替代的基於細胞免疫抑制療法的免疫抑制和分化特性。在我們的項目中，使用和評估了用CXCR4基因和標記蛋白進行設計的MSCs。
分組
42隻BALB / c小鼠用IBD建立，分為5組：
（1）本實驗中包括10隻小鼠。致敏後，6隻小鼠注射MSCsCXCR4。
（2）本實驗中包括10隻小鼠。致敏後，6隻小鼠注射MSCseGFP。
（3）本實驗中包括10隻小鼠。致敏後，6隻小鼠注射生理鹽水。
（4）6隻小鼠用酒精作為酒精對照灌腸。
（5）未進行任何進一步治療的6隻小鼠作為正常對照組。
記錄結腸長度，DAI評分，存活率，細胞因子濃度和HE染色。通過IVIS光譜觀察體內具有熒光素酶的MSC。
DTH
延遲型超敏反應（DTH）是人類過敏性接觸性皮炎（ACD）的實驗模型，是全世界流行的皮膚疾病之一。在炎症的高峰期，效應T細胞和各種先天免疫細胞，特別是肥大細胞（MCs）被激活併產生許多有助於濕疹病變的炎性細胞因子。目前，皮質類固醇的局部應用是短期結果的ACD的一線姑息治療措施，而改善接觸避免的過敏原鑒定仍然具有挑戰性。因此，各種免疫細胞對MSC的獨特免疫調節功能可能使其成為使過敏性疾病脫敏的新方法。在我們的項目中，使用和評估了用CXCR5基因和標記蛋白進行工程改造的MSCs。
分組
在我們的設計中，28隻BALB / c小鼠建立DTH，分為4組：
（1）本實驗中包括8隻小鼠。致敏後，6隻小鼠注射MSCsCXCR5。
（2）本實驗中包括8隻小鼠，用於治療致敏和將MSCseGFP注射到尾靜脈。
（3）本實驗中包括6隻小鼠，其中治療致敏並將PBS注射到尾靜脈。
（4）該組中的6隻小鼠接受相同體積的丙酮/橄欖油溶液施用於背部和耳朵。PBS注射到尾靜脈。
測量耳朵樣品並收穫qPCR，HE染色或免疫熒光。
主要的成就
1.我們調整後的MSCs仍保持有自己的特性。
2. CCR7 / CXCR4 / CXCR5在我們改良的MSC上成功過表達。
3.我們工程化MSC的趨化性有所改善。
4.標記蛋白（eGFP / dTomato /螢光素酶）工作正常。
5.我們工程化的MSC對炎症性腸病（IBD）的治療效果得到改善。
6.我們工程化的MSC對延遲型超敏反應（DTH）的治療效果得到改善。
7.開關元件工作正常。
未來的工作
標記蛋白
由於將eGFP / dTomato和螢光素酶應用於人體是不合理的，因此我們將改進我們的設備，並將其應用於臨床前和臨床藥物研究。利用功能成像，這裡我們改進了以前的iGEM基本部件：BBa_I712019到兩個複合部件BBa_K1993006和BBa_K1993011。
對於BBa_K1993006，我們構建了熒光素酶與dTomato和hFTH的編碼序列作為我們的全標記系統。我們在未來的應用中選擇hFTH作為報告蛋白，因為無毒細胞內鐵蛋白鐵儲存的升高導致T2鬆弛時間的相應變化。
BBa_K1993011是我們設計的完整形式：CXCR4的基因連接到全標記系統的編碼序列。
在未來的工作中，我們將分別測試每個部分的功能，並著重於hFTH的有效性。
轉染
在我們的設計中，我們選擇了慢病毒來轉移我們的系統。然而，鑒於慢病毒的致癌性風險，更為安全的方法是必要的。在我們未來的工作中，我們嘗試以各種方式轉運質粒，如電穿孔，脂質體，粒子轟擊等。
切換開關
在未來的工作中，我們將利用開關實現程序死亡，通過引入自殺基因，標記蛋白質和IL-10的基因來區分MSC和抗炎細胞因子表達。
圖1.3.3
根據我們的預實驗結果，我們設計了一個在α-SMA啟動子下的切換，能夠檢測炎症環境並啟動下游基因表達。
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