看見神經：從卡哈爾到現代神經解剖學 | 神經專欄
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大腦的擴散核磁共振（diffusion MRI）
編者按
神經解剖學是神經科學的基礎。在神經解剖學的研究中，最根本的技術就是標記和成像觀察技術。人類只有藉助不斷發展的標記和觀測技術，獲得更細緻地觀察，才能更好地理解它的功能、研究它的狀態。以卡哈爾採用改良銀染法開拓現代神經科學為開端，神經解剖技術讓我們清晰地看到了大腦的組織結構。
20世紀70年代之後的示蹤技術趨於成熟，各類示蹤劑以及病毒的應用為神經解剖學的研究帶來了質的飛躍；近年來，基於病毒的神經示蹤技術、透明腦、全腦成像（MOST，光片技術）、電鏡重構等現代技術，科學家們在各個層面更進一步地推動神經解剖的發展，為神經科學的發展鋪就堅實的基礎。
本文由上海科技大學生命科學與技術學院胡霽老師（助理教授、研究員）策劃。
撰文 | 賈曉寧、李德康、李天昊、塗洪清（上海科技大學）
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現代神經科學的奠基人——卡哈爾
自人類擁有智慧以來，「認識自身」就是我們一直試圖達到的、樸實又富有深刻哲學內涵的目標。追溯生命意識的起源和形成、揭示生命各項活動的「靈性」的本質，生命科學在此過程中逐漸誕生、成型。神經科學，這一學科向智慧的根源的探求在這認識自身的漫長圖卷中如同丹砂青雘，既為基礎，又顯華美。
認識大腦的現代神經科學發源於19世紀末20世紀初。如同絕大多數的科學門類需要一個天才以及天才的理論來奠定基礎，神經科學的正式確立離不開偉大的病理學家、組織學家聖地亞哥·拉蒙-卡哈爾
（Santiago Ramóny Cajal）
的研究成果和理論。為此，卡哈爾被譽為「現代神經科學之父」。
在神經科學的研究中，最重要的技術就是成像觀察技術。人類只有藉助不斷發展的觀測技術，更加細緻地觀察到神經系統的真實模樣，才能更好地理解它的功能、研究它的狀態。而神經系統承載著至關重要的功能，決定了它是生命體中最複雜的、最難觀察的結構。這也就導致了人類對神經科學的研究，始終伴隨著標記和成像等技術的發展而前進。
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聖地亞哥·拉蒙-卡哈爾早在1873年，義大利科學家卡米洛·高爾基首創鉻酸鹽-硝酸銀染色法，將解剖獲得的組織中的神經元和膠質細胞的細胞體和突起染成棕黑色，而未被染色的細胞呈無色，易在光學顯微鏡下觀察、用手繪圖片記錄。這是人類最早的神經科學觀察成像技術。這一染色方法也被命名為「高爾基染色法」。
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卡米洛·高爾基卡哈爾在同一時期也在積極開展神經組織的解剖、觀察和研究。他對高爾基染色法有所改進，即換用了更高濃度的重鉻酸鉀、延長了第二步硝酸銀浸泡暗處理的時間，從而獲得了更充分可靠的染色樣本。在高爾基心愛的Zeiss光學顯微鏡下
（他任教於巴倫西亞大學期間受到的獎勵，在他的自傳中他強烈表達了自己彼時的喜悅）
，憑藉著自己高超的觀察能力和繪畫技藝，他完成了數百幅美觀、細緻的神經解剖學繪圖。這些繪圖後來長期被用作教學的範本，直到現在仍然可以出現在教材的對應章節中。
之所以說卡哈爾是天才，絕不僅僅因為他針對客觀事物細緻入微的觀察以及嚴謹而認真的記錄，更是因為他對神經結構功能的理解和分析。卡哈爾確定了若干個重要的規律，並且在研究中始終貫徹：
神經系統由神經元這樣的基本單位構成，但在研究功能時，需要整體考慮各個結構之間的相互作用；
神經信號
（卡哈爾的用詞是『nervous current』）
的傳導大多是單向的，由樹突到神經元細胞體再到軸突；
神經元之間是生理結構上不連續的，神經信號可以跨過這種不連續的結構而傳遞下去。
基於這些規律，卡哈爾對於觀察到的解剖結構如何發揮功能的過程也有詳盡的分析與猜想。下面是一個典型的例子。
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上圖是卡哈爾繪製的脊椎動物視神經相關通路的圖片。在圖中，卡哈爾已經繪製出了神經之間不連續的結構（後人命名為突觸），並且解釋了低等脊椎動物（左圖）和高等脊椎動物（右圖）在神經系統相關組織結構上不同的原因。
後人在更先進的技術以及更精密的儀器支持下，證明了卡哈爾的結論正確性。作為染色方法真正的發明人的高爾基在同一時期提出了截然不同的結論，即神經聯結成為網路，沒有單向傳導、生理不連續的特徵。直到1906年二人都因為在神經科學領域的巨大貢獻被授予諾貝爾獎。當他們站到頒獎台上的那一刻，分歧仍然沒有彌合。卡哈爾是幸運的，他得到了更接近事實的結論，所以被譽為了「神經科學之父」，但高爾基也沒有被歷史遺忘，更多人所熟知的細胞器——高爾基體，正是以他的名字命名的。
高爾基銀染法是跨時代的，但不足以支撐對神經元更深入、更細緻的研究，染色的方法既不能揭示神經纖維之間的聯繫，也不能界定特定神經元的完整分布區域，多個神經細胞的軸突、樹突交叉在一起時，很難判斷一段神經纖維屬於哪一個或哪一群胞體；況且切片後的神經組織難以觀察到完整的神經元。在如此艱難的情況下，也無怪乎高爾基把神經當做連接起來的網狀結構了。
科學永不止步，卡哈爾憑藉其天才的觀察力和想像力，從粗陋設備獲得的模糊數據得出了精確的結論。
神經示蹤劑
20
世紀70年代以來，一種新型的利用神經示蹤劑
（tracer）
觀察神經細胞形態的方法逐漸發展起來。注入在神經細胞附近的示蹤劑會被神經元特異性吸收，示蹤劑在神經元內依靠細胞內的轉運功能擴散到神經元的各個角落，以此達到示蹤的目的。順行示蹤劑（anterograde tracer）
在細胞內順著信息流的方向擴散，也就是在胞體部位注射示蹤劑，示蹤劑向神經末梢傳遞；逆行示蹤劑（retrograde tracer）
與之相反——在神經末梢部位注射，示蹤劑逆信息流方向傳遞。病毒作為示蹤劑
然而傳統示蹤劑並不是完美的。人們認為，理想的示蹤劑需要具備如下五點特性：第一，它能特異性且高效得被神經元細胞吸收；第二，它能靶向一類特定的動力蛋白，表現出特異地順行或逆行傳導；第三，它的信號可視化且能夠被穩定地放大；第四，其可應用多種顏色以便使用多種示蹤劑；第五，一些示蹤劑可以信號不衰減地跨突觸傳遞。
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不同示蹤劑的注射方法
嗜神經病毒是一類可以感染神經細胞，且能沿神經環路增殖傳播的病毒。20世紀末，人們已經開始改造並利用這類病毒的疫苗株作為全新的示蹤劑，且一直沿用至今，成為了目前最高效的一類示蹤劑。
嗜神經病毒在細胞特異性、示蹤效率、跨突觸示蹤方面顯著優於傳統示蹤劑。特別是近年，在反向遺傳學和同源重組基因編輯技術飛速發展下，人們對病毒示蹤劑的運用更加靈活和廣泛。在疫苗株的基礎上，改造病毒基因組，敲除特定毒力基因，插入熒光蛋白等外源基因，獲得低毒力、安全、攜帶標示物的重組示蹤工具病毒。
根據病毒示蹤劑能否擴增從而跨突觸標記，可分為兩大類。不能跨突觸的病毒示蹤劑又可根據病毒的種類分為逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒等，適合作為表達外源基因的載體。逆轉錄病毒會將基因組整合進神經元細胞基因組，表達穩定長效；但是滴度與其他病毒相比略低。腺相關病毒滴度高、表達穩定長效、幾乎無毒，且可以用同源重組進行編輯，是實驗室廣泛使用的一類；缺點是能夠攜帶的外源基因較小，長度在4.8kb左右。腺病毒滴度高、感染迅速，也同樣可以運用重組編輯；但病毒的衣殼蛋白會引起炎症反應。
能夠跨突觸的病毒示蹤劑常使用的主要有兩類，分別是皰疹病毒和彈狀病毒。這類病毒因為保留了病毒的複製能力，相應地，其擁有快速的感染能力和不小的毒性。皰疹病毒最常用的是逆行示蹤的偽狂犬病毒
（PRV）
的Bartha strain和順行示蹤的α-皰疹病毒HSV-1 strain H129。
傳統示蹤劑和普通的病毒示蹤劑無法解決的一個問題是示蹤劑無法特異性地選擇指定神經元。於是人們在皰疹病毒示蹤劑上首次使用了CRE-LoxP系統加以實現。2001年，DeFalco等利用了CRE-dependent PRV實現了選擇性標記特異類型神經元的輸入環路，使得病毒只能從指定神經元開始逆行示蹤。但PRV的缺點在於，無法感染靈長類動物神經。於是人們採用彈狀病毒來完成對靈長類動物的研究。彈狀病毒主要有逆行示蹤的狂犬病毒
（RV）
和順行示蹤的水泡型口炎病毒（VSV）
兩類。
普通跨突觸病毒示蹤劑用神經元細胞存活時間來判斷級聯關係，然而考慮到細胞的自身特性和病毒的劑量，且伴隨著時間的流逝，神經通路的複雜性使得判斷變得不夠準確。Wickersham等利用RV疫苗株Sad B-19構建了能夠實現跨單突觸的示蹤劑。該示蹤劑同樣用到了Cre-LoxP重組技術和AAV病毒載體等工具，為現代複雜神經環路示蹤等神經科學研究奠定了基礎。
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RV病毒跨單突觸示蹤技術設計草圖
對病毒示蹤劑的開發還遠沒有結束，未來的方向將聚焦於降低毒性、更多基因編輯和探尋多樣性的實驗物種材料入手。
透明腦
神經科學工作者一直想要實現的目標是知道於某個特定的時刻、在某個特定的區域，大腦具體發生了什麼。為了實現這一目標，神經示蹤技術自然必不可少，但即便具有了發展較完備的各類神經示蹤劑，以及病毒等可作用於活體的示蹤技術，想要看穿大腦，仍存在一個重要的問題亟待解決：那就是我們觀測的高等生物的腦組織是不透明的，正如我們平時吃的腦花，都是白乎乎的。
這意味著光信號難以在樣本深處傳入和傳出。尤其是採用多聚甲醛固定的樣品，即便使用先進的雙光子顯微鏡，固定樣品也只能成像到約300微米左右的深度
[v]
。面對難題，除了不斷研發性能更加先進的顯微成像技術外，科學家們給出的另一個解決辦法是「把整個大腦變透明」，也即「透明腦技術」。近年來研究者開發了數種透明腦技術，列舉兩例：一是日本理化學研究所發育生物學中心
（RIKEN）
研發的，利用一種果糖水溶液（SeeDB）
，浸泡已固定的腦組織或胚胎樣本數日，研究人員便可以結合雙光子顯微鏡，觀測到小鼠腦結構固定標本毫米級的深度。
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透明腦，圖自 RIKEN這是因為樣品的不透明性究其原因是由光吸收和光散射兩部分造成，在成像哺乳動物樣品時光的散射為主要不透明原因。而高濃度的蔗糖溶液此前已有被用來減輕腦和無脊椎動物的樣品的光散射的案例，SeeDB更進一步，利用果糖水溶液更高的光學折射率
（1.502 at 37 °C，86.7% wt/wt, ~130% wt/vol）
，此折射率接近白質中阻礙透光性的脂質，故使用SeeDB不僅使得腦白質的不透明能清除更為徹底，也避免了此前使用蔗糖溶液時會出現的樣品收縮和耗時過長樣品損壞等缺點。SeeDB可以做到保留錐體神經元、樹突棘等精細結構。
另一個透明腦技術為斯坦福的CLARITY技術，他們的策略更加「簡單粗暴」——研究人員選擇直接用透明材料替換脂質來消除不透明性。他們使用丙烯胺單體溶液浸泡樣品，直到丙烯胺單體完全浸潤組織深處。然後稍稍加熱到體溫附近，使得單體發生聚合反應，構成的聚丙烯胺凝膠高分子網路能夠有效支撐組織，此時使用去污劑等完全抽離細胞結構中原本的脂質，就得到了由透明的聚丙烯胺水凝膠支撐的腦組織樣本，結合神經示蹤技術即可獲得腦組織深處的圖像。
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圖自http://clarityresourcecenter.orgCLARITY
除了可以用於神經組織外，也可以被擴展利用到其他需要實現透明化組織，已被實現的有肺
(Joshi, 2015; Saboor, 2015)
、肝(Font-Burgada,2015)
甚至完整個體/胚胎(Epp, 2015;Yang, 2014)
。
總結與未來
基於觀測技術的發展和觀測數據的積累，科學家建立資料庫以保存和交流這些觀察到的數據和圖像，一個著名的腦神經科學資料庫是ALLEN BRAIN ATALS
（阿蘭腦圖譜）
，ABA基於基因組學和神經解剖學數據，構建了小鼠和人的腦部基因表達地圖，使得研究者能方便的利用已有的研究數據去定位某個神經元的投射位置和方向以及相應基因的表達情況。
縱觀神經解剖學發展的歷程，我們能看到伴隨著時間軸並進的另外幾條發展脈絡：
一是觀察的結果由粗糙到細緻。卡哈爾的成果在百年前可謂是不可思議般的精妙；但百年之後的今日，即便不是專業研究者，也會認為卡哈爾時代的銀染法所繪製的神經圖案是較為粗糙的。給出這種評判的自信正是源於這百年間各類示蹤技術的發展和成像手段的進步，使我們對結構的觀察結果開始具有相當高度的要求。我們今日的掃描成像及重構技術已經可以精確地描述突觸以及更小的神經細胞的次級結構，倘若再經百年，又會是何情形？
二是觀察的範圍從小到大。卡哈爾當時所能觀察的樣品大小為其銀染範圍所限，是局部而缺損的。如今的透明腦等技術的發展，使得我們能夠對一個完整的組織樣本甚至個體樣本進行細緻的觀察，無疑使得神經形態學的研究更加具有整體性。而Allen腦圖譜等資料庫的建立，也使得各個局部的數據得到拼合，並能夠結合遺傳學等其他學科的研究內容。
三是觀察的對象從死到活。神經科學不僅需要觀察已有的神經形態，還需要觀察動態的神經發育過程，這就需要能夠在活體樣本中工作的成像技術。得益於不斷發展的各類示蹤技術和顯微成像手段，我們已經能夠觀察活體樣本的神經發育過程。更一步的，將超微結構的成像做到動態化則是我們寄希望於不遠未來能夠實現的理想。
神經解剖學是觀察和記錄的學科，可以說是作為築於其上的、對發育和功能的研究的根基；而再在其上，又會有基於神經科學的各項交叉學科，如認知科學、神經行為學、神經工程學以至心理學。
想要寫作首先要會理解、想要理解首先要會閱讀、而想要閱讀我們需要能夠看見，作為諸學科根基的神經解剖學所做的正是實現「看見」、「看清」這麼簡單卻無比重要的目標。因為看見，所以向前——基礎的進步抬升學科的前沿，前沿的突破又帶來基礎的發展，科學就是這樣一種螺旋上升、永不停止的文明之階
。
製版編輯：常春藤
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