益生菌來源的高鐵色素通過氨基末端激酶介導的細胞凋亡抑制結腸癌進程

最新 09-04

Probiotic-derived ferrichrome inhibits colon cancer progression via JNK-mediated apoptosis

益生菌來源的高鐵色素通過氨基末端激酶(JNK)介導的細胞凋亡抑制結腸癌進程

Hiroaki Konishi, Mikihiro Fujiya, Hiroki Tanaka,et al. Probiotic-derived ferrichrome inhibits colon cancer progression via JNK-mediated apoptosis[J]. Nature Communications, 2016, 7:12365.

影響因子（2016）：11.329

1)本文目的為使用不同分子量的超濾膜、微量Float-A-Lyzer透析裝置、層析柱、AKTA-HPLC、凝膠過濾層析、離子交換色譜、正相和反相色譜等手段分離，質譜分析鑒別L. casei ATCC334產生的腫瘤抑制分子。這是首次鑒別源於益生菌的抗腫瘤分子的研究。

2)探究高鐵色素對結腸癌的生長抑制作用（體外SRB）、細胞毒性評價、在體內抑制腫瘤生長的作用（動物模型）及其腫瘤抑制機制。

益生菌與人體健康休戚相關，如調節腸道菌群、抑制過敏反應及抑制腫瘤的發生和發展。已有研究表明結腸癌病人腸道菌群發生了異常變化，而這些微小的變化可能與結腸癌的發生和進展密切相關。此外，包括乳桿菌和雙歧桿菌在內的益生菌在結腸癌細胞株和小鼠/大鼠腫瘤模型中顯示出腫瘤抑制作用，這表明食用足量的益生菌可能對腫瘤的發生和發展起到一定的預防和治療作用。

宿主和微生物互作研究表明：一些細菌分泌的有效分子能激活細胞生存途徑，例如源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的細胞集落刺激因子（CSF）會誘導熱激蛋白（Hsps）的表達,並通過有機陽離子轉運體2（OCTN2）激活蛋白激酶B（Akt）細胞的生存途徑，從而發揮一定的細胞保護作用;從短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的培養上清液中分離出的無機聚磷酸鹽也能誘導Hsps的表達並通過整合蛋白的信號轉導通路β1-p38MAPK發揮細胞保護作用。此外，Yan等人確定了兩種多肽p75和p40,是擁有抗性凋亡性質的活性成分,並能激活細胞生存力；同時也發現鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus GG）能引發Akt信號通路。這些研究表明宿主和微生物的相互作用能通過某些腸道微生物的特定分子給宿主帶來一定的健康益處。

基於這些研究，本文對益生菌來源的腫瘤抑制分子進行分離鑒定，並且探究其腫瘤抑制機制。旨在為得到益生菌來源的腫瘤抑製劑提供技術研究和理論支持。

研究對象：L. casei ATCC334培養上清液，三種結腸癌細胞株Caco2/bbe、SKCO-1和SW620，以及高鐵色素。

實驗設置：

將L. casei ATCC334培養上清液通過各種分離柱分離，得到對結腸癌細胞株的生長有抑制作用的有效成分,並利用質譜分析對此成分進行鑒定。質樸分析結果顯示從L. casei ATCC334培養上清液分離出的腫瘤抑制組分中含有高鐵色素。

SRB試驗表明，當高鐵素的濃度＞100ng/ml時，它可以顯著抑制Caco2bbe和SW620的細胞增殖（圖5a，b）。SRB試驗也表明在對L. casei ATCC334培養物上清液利用LCN2或ARN1將高鐵素沉澱處理之後，其腫瘤抑制作用降低了，這表明高鐵色素能夠調節L. caseiATCC334的腫瘤抑制功效。

為了評價其毒性，將高鐵素和IEC-18細胞株、源於老鼠小腸的原代培養細胞共同培養。在IEC-18細胞中，在1μg/ml的濃度時觀察到高鐵素對對細胞生長的抑制作用（圖5c），但是在原代培養細胞中沒有觀察到顯著抑制作用（圖5d）。

將高鐵素對SW620細胞和IEC-18細胞生長的抑制作用同5-氟尿嘧啶（5-FU）和順鉑等抗癌藥物作比較,SRB試驗顯示，在SW620細胞中高鐵素的腫瘤抑制效果大於抗癌藥物,而在IEC-18細胞中高鐵素的腫瘤抑制效果更低（圖5e,f）。

綜合以上這些結果，高鐵色素不僅能抑制結腸癌細胞的生長，相對於5-FU和順鉑等抗癌藥物，對正常腸道上皮細胞的危害也更小。

將2×106的SW620細胞的細胞懸液注射到裸鼠背部來建立腫瘤動物模型，從而確認高鐵素在活體內對結腸癌進程的抑制作用。將高鐵色素或PBS注射到腫瘤部位，每天測定腫瘤大小，結果顯示用高鐵色素處理的實驗組對腫瘤生長的抑制作用顯著要高於PBS處理組（圖6a,b）。

為了弄清高鐵素對癌細胞凋亡的影響，評估了裂解caspase-3（細胞凋亡蛋白酶）和核聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的表達情況。免疫印跡分析顯示SW620細胞中的裂解caspase-3和PARP表達情況顯著上升，且表達量隨著劑量的增加而升高（圖7a）。

此外，原位末端凋亡法染色顯示經高鐵素處理的細胞中的凋亡細胞數目比對照組細胞中的要高（圖7b）。這些數據表明高鐵色素通過誘導結腸癌細胞中的細胞凋亡來發揮腫瘤抑制作用。

利用高通量測序分析來測定SW620細胞用高鐵素處理之後引起的mRNA表達上的變化。結果顯示有275種mRNAs顯示出變化，這在統計學上相對於對照組細胞變化顯著，且是其2倍多。用MetaCore software programme進行的通路分析結果表明，ER應答通路和經高鐵素處理的細胞中的這些mRNA變化相關。DDIT3能調節ER來介導細胞凋亡,其mRNA是這些mRNAs中上調幅度最大的一種;在經高鐵素處理的細胞中，用RT-PCR和免疫印跡分析分別證實了DDIT3的mRNA劑量依賴型上調和蛋白水平（圖7c,d）。

為了識別與高鐵素腫瘤抑制作用相關的信號轉導通路，測定了pp44/42MAPK(ERK)，蛋白激酶B(Akt)，c-jun氨基末端激酶(JNK，p38MAPK和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)信號通路的改變。免疫印跡分析結果表明在經高鐵素處理的SW620細胞中，pJNK以劑量依賴型的方式（即上調幅度隨著高鐵素的量的增多而上升）上調了（圖7e）。