Lnc HIFCAR/MIR31HG如何作為HIF-1a的共激活物促進口腔癌進程

Long noncoding RNA LncHIFCAR/MIR31HG is a HIF-1a co-activator driving oral cancer progression

一、調控通路

細胞在低氧的環境下，LncRNA HIFCAR結合到HIF-1a靶標基因的啟動子上招募HIF-1a和P300形成轉錄複合體，促進基因的轉錄，從而促進腫瘤進程。

二、實驗流程

作者首先通過對低氧處理的細胞、腫瘤細胞、正常組織細胞檢測LncRNA HIFCAR的表達和臨床檢測確定本文的主角。對LncRNA HIFCAR的研究作者分為功能和機理研究。功能實驗包含對LncRNA HIFCAR敲低、低氧處理細胞後檢測細胞的增殖、侵襲和轉移、腫瘤成球和小鼠體內成瘤等。機理實驗：首先是檢測LncRNA HIFCAR對HIF-1a靶標基因表達的影響，作者通過LncRNA HIFCAR的過表達/敲低和低氧處理後檢測靶標基因的表達驗證LncRNA HIFCAR對HIF-1a靶標基因表達的促進作用。然後是LncRNA HIFCAR與HIF-1a互作使形成蛋白複合物，作者通過熒光素酶實驗、RIP、RNA pull-down和co-IP驗證LncRNA HIFCAR與HIF-1a和P300的關係。最後是驗證LncRNA HIFCAR、HIF-1a和P300結合到靶標基因啟動子上，作者通過CHIRP和CHIP實驗來驗證。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是LncRNA HIFCAR/MIR31HG通過與HIF-1a互作激活靶標基因的表達。

A、q-pcr檢測LncRNA HIFCAR和RMRP表達細胞中HIF-1a的靶標基因的RNA表達水平，表明LncRNA HIFCAR表達使HIF-1a的靶標基因表達上升。

B、q-pcr檢測不同數量的LncRNA HIFCAR過表達細胞的HIF-1a的靶標基因的RNA表達水平，表明隨著LncRNA HIFCAR表達升高，HIF-1a的靶標基因的RNA表達也升高。

C、q-pcr檢測CoCl2處理的LncRNA HIFCAR敲低細胞的HIF-1a的靶標基因的RNA表達水平，表明LncRNA HIFCAR敲低使HIF-1a的靶標基因的RNA表達降低，CoCl2處理使HIF-1a的靶標基因的RNA表達升高。

D、q-pcr檢測低氧處理的LncRNA HIFCAR敲低細胞的HIF-1a的靶標基因的RNA表達水平，表明LncRNA HIFCAR敲低使HIF-1a的靶標基因的RNA表達降低，低氧處理使HIF-1a的靶標基因的RNA表達升高。

E、熒光素酶實驗，將HIF-1a受體序列連接到熒光素酶基因的啟動子區，與LncRNA HIFCAR表達質粒共轉染細胞後檢測熒光素酶活性，表明在添加HIF-1a和LncRNA HIFCAR使熒光素酶活性顯著增強。

F、熒光素酶實驗，將HIF-1a受體序列連接到熒光素酶基因的啟動子區，與LncRNA HIFCAR敲低質粒共轉染細胞後檢測熒光素酶活性，表明LncRNA HIFCAR敲低降低熒光素酶活性，而添加HIF-1a和低氧處理後使熒光素酶活性顯著增強。

Figure2說明的是LncRNAHIFCAR與HIF-1a結合作為HIF-1a的共激活劑。

A、WB檢測經低氧處理後的LncRNA HIFCAR敲低和過表達細胞的HIF-1a表達水平，表明LncRNA HIFCAR敲低或過表達不影響HIF-1a的表達，而低氧處理促使HIF-1a表達。

B、RIP實驗，用HIF-1a抗體釣取低氧處理和不處理細胞中與HIF-1a蛋白結合的RNA，然後進行Q-PCR檢測，表明低氧處理會使HIF-1a與LncRNA HIFCAR顯著升高。

C-E、RNApull-down，不同片段的LncRNA HIFCAR釣取結合的蛋白驗證了與HIF-1a結合的RNA區段。

F、對LncRNAHIFCAR全長和501-1500區段過表達後檢測HIF-1a靶標基因的表達，表明LncRNA HIFCAR全長過表後HIF-1a靶標基因的表達升高，而501-1500區段過表達後，HIF-1a靶標基因的表達比全長過表達顯著降低。

G、GST-pull-down，將HIF-1a不同區段與GST標籤進行融合表達後釣取與融合蛋白結合的RNA然後檢測LncRNA HIFCAR，表明HIF-1a結合LncRNA HIFCAR的區域在201-329位氨基酸之間。

H、co-IP，用HIF-1a抗體從低氧處理和未處理的LncRNA HIFCAR敲低細胞中釣取結合的蛋白，表明低氧處理促使HIF-1a複合體形成。

Figure3說明的是LncRNAHIFCAR結合到HIF-1a靶標基因啟動子上招募HIF-1a和P300結合到啟動子上.

A、CHIRP，用LncRNA HIFCAR探針釣取低氧處理和未處理細胞中與之結合的DNA片段，然後進行Q-PCR檢測，表明經低氧處理後的細胞LncRNA HIFCAR結合到HIF-1a靶標基因啟動子上。

B-C、ChIP，分別用HIF-1a和P300抗體釣取低氧處理和未處理的LncRNA HIFCAR敲低細胞中與蛋白結合的DNA片段，然後進行Q-PCR檢測，表明低氧處理後細胞中HIF-1a和P300結合到HIF-1a靶標基因啟動子上，而LncRNA HIFCAR敲低會使結合降低。

本公司可提供技術服務

本公司可進行以上類似實驗的實驗設計及整體實驗外包項目，包括Luciferase檢測、q-pcr、RIP、RNA pull-down、co-IP、CHIRP、ChIP、WB、慢病毒穩轉株的建立（過表達/敲低），其中CHIP、Luciferase檢測、EMSA、pull-down為本公司主營項目。

一、Luciferase檢測：檢測轉錄因子和其靶啟動子中的特異序列結合的重要手段

將HIF-1a受體序列連接到熒光素酶基因的啟動子區，與LncRNA HIFCAR表達質粒或敲低質粒共轉染細胞後檢測熒光素酶活性，表明在添加HIF-1a和LncRNA HIFCAR使熒光素酶活性顯著增強。

二、RIP技術：是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。

用HIF-1a抗體釣取低氧處理和不處理細胞中與HIF-1a蛋白結合的RNA，然後進行Q-PCR檢測，表明低氧處理會使HIF-1a與LncRNA HIFCAR顯著升高。我公司在實驗體系中設置陽性及陰性對照，進一步排除系統誤差。

三、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。

左圖是用LncRNA HIFCAR全長探針釣取細胞中與之結合的蛋白，右圖是用LncRNA HIFCAR不同片段探針釣取細胞中與之結合的蛋白，然後用HIF-1a抗體檢測pull-down產物蛋白，表明LncRNA HIFCAR與HIF-1a的結合區域不在501-1500。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、CO-IP：確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

用HIF-1a抗體釣取LncRNA HIFCAR敲低和未敲低細胞中與之結合的蛋白，產物進行WB檢測，表明HIF-1a與P300結合形成複合體，而LncRNAHIFCAR敲低細胞中結合降低。

五、CHIRP：是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。

用LncRNA HIFCAR探針釣取低氧處理和未處理細胞中與之結合的DNA片段，然後進行Q-PCR檢測，表明低氧處理後的細胞LncRNA HIFCAR結合到HIF-1a靶標基因啟動子上增加。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

六、CHIP技術：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關係

分別用HIF-1a和P300抗體釣取低氧處理和未處理的LncRNA HIFCAR敲低細胞中與蛋白結合的DNA片段，然後進行Q-PCR檢測，表明低氧處理後細胞中HIF-1a和P300結合到HIF-1a靶標基因啟動子上，而LncRNA HIFCAR敲低會使結合降低。

參考文獻：Jing-Wen Shih, Wei-Fan Chiang, Alexander T.H. Wu,et al. Longnoncoding RNA Lnc HIFCAR/MIR31HG is aHIF-1a co-activator driving oral cancerprogression［J］. NATURECOMMUNICATIONS,2017, 8:15874

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