位點特異性重組酶介紹

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我們通常會用到特異性位點重組酶，如我們都熟知的Cre-Lox,TALENs,鋅指系統,CRISPR-Cas9，這些都是保守的位點專一性重組（CSSR）。事實上，CSSR是從微小的細菌種借用的技術。儘管這些系統存在於真核生物、原核生物和噬菌體中，但我們通常在基因工程中使用的通常是細菌。特別地，λ噬菌體使用λ整合酶整合到其細菌宿主中，沙門氏菌利用Hin重組酶來表達替代基因。

CSSR系統都有共同的特點:

1、它們由兩個主要元素組成:酶和重組位點。

2、重組位點必須存在於DNA分子的重組過程中。它們為酶提供了一個攻擊位點，並有助於其特異性。

3、根據位點的方向，反應的結果可能是一個DNA片段的刪除，另一段的插入，DNA分子內的反轉等。

4、這個過程是「保守的」，因為在這個過程中每一個DNA鍵都斷裂再重新加入。

5、這個過程涉及共價的蛋白- DNA中間體的形成。

從結構上講，有兩個重組酶家族:

一、酪氨酸重組酶類

酪氨酸重組酶類在其活性位點上有一個Tyr殘基，其側鏈攻擊連接到DNA。這一機制是已知的，具體如下:

1.酶的兩個亞基附著在兩個DNA分子上，值得注意的是，酶沒有四重對稱——在任何時候，只有兩個斜對角的亞基處於活躍的構象中。

2.活性亞基的Tyr殘基附著在其自身DNA分子一條鏈上的5』磷酸基上,留下一個遊離的3』-OH基團。

3.3』-OH基團附著在另一DNA分子的暴露磷酸基團上，形成一個霍利迪連結體（Holliday junction）。現在，一條鏈與另一個DNA分子的同源鏈結合在一起，而這兩個分子中的另一條鏈保持不變。

4. 然後，酶的相對亞基轉化為活性構象，之前的活性構象變得不活躍。這些新的亞基攻擊DNA分子未受影響的第二條鏈，連接到5 磷酸基時留下一個暴露的3 -OH末端。

5. 3』-OH連接到不同分子的5 磷酸基，這樣這兩個分子經歷了重組。

二、絲氨酸重組酶類

絲氨酸重組酶系統在其與DNA結合的活性位點上有一個Ser殘基。它與酪氨酸重組酶作用機制的主要區別在於，DNA分子的兩條鏈都斷裂，然後將它們連接到相反的分子鏈上。

1.兩個亞基對附著在兩個DNA分子三，每個亞基對應一條鏈。所有的亞基同時都是活躍的，在每條鏈上絲氨酸殘基攻擊5 磷酸基。

2.所有的四條鏈都斷裂，產生了4個3 -OH基團，它們可以攻擊不同分子的相應鏈。

3.蛋白質結構變化，不同鏈的3 -OH和5 磷酸基團發生重排。

4.DNA鏈同時連接，產生重組分子。

三、應用和未來的潛力

在使用的重組酶中，大多數是Tyr重組酶系統，如Cre-Lox重組系統。這些方法可以幫助你目的基因敲除，或者用特定的重組位點「播種」胚胎細胞，是以後重組酶的目標。這有助於科學家研究基因，在正常發育的胚胎階段，它們的刪除可能會致命。

相比之下,絲氨酸重組酶,如φC31-Int在轉基因研究中是有幫助的。它有識別單一重組位點的傾向，酶以幾何方式鎖定。然而，其在合成生物學中的應用發展迅速，尤其是在E. coli的基因工程表達。

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