技術方法｜離體股骨頭動脈顯微灌注技術方法

離體股骨頭動脈顯微灌注技術方法

邱興¹， 程亮亮¹， 王本傑¹， 楊磊¹， 趙德偉¹

大連大學附屬中山醫院骨科，遼寧大連 116000

【摘要】 目的探索豬股骨頭標本離體後支持帶動脈顯微灌注技術方法。方法顯微鏡下對12例離體豬股骨頭標本顯微灌注，顯微CT掃描；血管三維重建。結果通過下支持帶動脈對離體豬股骨頭顯微灌注及骨內血管三維重建。構建離體股骨頭的數字化三維模型，可精確、清晰呈現股骨頭內動脈主幹及其分支的形態結構。結論離體豬殷骨頭動脈顯微灌注及骨內血管三維重建能夠清晰顯示豬股骨頭骨內的血管。為殷骨頭缺血性壞死研究提供形態學基礎。

【關鍵詞】股骨頭；骨內血管；顯微灌注；顯微CT；三維

【中圖分類號】R322.34

【文獻標識碼】A

【DOI】10.13418/j．issn．l001-165x.2017.04.025

骨內血液供應在骨的生長和修復重建過程中輸送營養物質營養骨內細胞，骨內血管結構對骨細胞具有重要意義。傳統研究骨內微血管的結構研究方法，通常需要先行骨內微血管造影然後對標本分割脫鈣，X線攝影進行觀察，耗時長，血管重建困難，不便於作為一個整體對其研究，不便於進行血管管徑測量，具有一定的局限性^[1]。正常屍體局部完整的標本可通過股動脈等大血管灌注顯微CT掃描，不破壞骨質重建骨內血管，對骨結構和骨內血管進行研究^[2]。研究對象多為正常整體的屍體解剖組織結構研究^[2-4]。離體股骨頭標本骨內血管研究的技術方法報道較少，需要先分割脫鈣處理，耗時長^[5]。本文對傳統血管統灌注技術進行改良，不須分割脫鈣，以豬離體股骨頭標本為例介紹其骨頭骨內血管顯微灌注研究方法。以期為股骨頭骨內血管研究提供參考。

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材料與方法

1.1 實驗標本

12例保留部分支持帶動脈的豬離體股骨頭標本。平均1年齡。本實驗研究經過醫院倫理委員會的批准。

1.2 實驗試劑與儀器

西門子Inveon MM系統Micro CT。圖像後處理軟體為Inveon Research Workplace (IRW)，Mimics14.0。恆壓灌注裝置（自製）。德國莎哈利本化學有限公司( Sachtleben Chemie GmbH)亞納米級硫酸鋇( Blanc Fixe Micro)，顆粒直徑700nm。Sigma公司明膠（產品編號V900863｜CAS號9000-70-8）。

1.3 造影劑配製及灌注方法

80℃水浴下將明膠融化製成5%明膠溶液，調整水浴溫度至37℃，加入硫酸鋇製成30%硫酸鋇混懸液100 ml備用^[2]。

12例離體新鮮豬股骨頭標本，灌注方法參考並改良股骨頭骨內血管定量研究。(1)顯微鏡下放大倍數約8倍，在下支持帶動脈即將進入股骨頭處插入外徑φ0.4 mm灌注導管針並結紮固定。(2)標本置於37℃水浴箱中，用恆壓灌注裝置將灌注液以恆壓(130～140 mm Hg)注入，灌注過程持續20 min。(3)結紮支持帶動脈並將標本置於0℃水浴20 min。待明膠充分固化，取出股骨頭標本。

1.4 Micro-CT掃描及骨內血管重建

標本固定於掃描床後Micro- CT掃描股骨頭。Inveon CT 採集協議為：Binningl， SystemMagnification low- med, Total Rotation 360, Real- timeReconstruction，Down sample factor 2，掃描解析度為24.37 μm，Exposure Time 200 ms。Inveon CT系統白帶的掃描重建軟體COBRA生成原始數據。導人影像分析軟體Inveon research workplace (IRW)生成並導出Digital imaging and communications in medicine( Dicom)格式文件，將該Dicom格式文件導人Mimics14.0。用Inveon Research Workplace (IRW)和Mimics進行血管圖像重建、體渲染、三維正交投影視圖(3Dorthogonal proj ection view)，並截圖。

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結果

2.1 股骨頭血管三維重建結果

本研究成功地通過單一支持帶動脈對12例離體豬股骨頭標本進行顯微灌注，顯微CT掃描，骨內血管三維重建（圖1）。股骨頭內均有血管網狀結構存在。顯微鏡輔助下血管灌注造影方法結合Micro-CT掃描能較好的觀察離體的豬股骨頭骨內動脈血管分布情況。

2.2 骨內血管體渲染和三維正交投影

以Volren體渲染和三維正交投影視圖(3Dorthogonal projection vlew)的方法整體的顯示豬離體股骨頭骨內動脈血管的分布。

三維正交投影視圖動脈血管顯影清晰，進入骨內的滋養血管的位置，血管管徑大小、走行走向、分支分布、與相鄰血管吻合等一目了然。其形態特徵與各級血管分支分布顯影突出；股骨頭骨內滋養血管及其分支分布顯影清晰明確（圖2）。

2.3 獲得標準化的Dicom格式文件

Inveon Research Workplace (IRW)生成的Dicom格式文件包含了骨的骨密度，骨小梁形態及分布，骨內灌注動脈血管的形態、分布、長度、長度密度、體積密度、血管分級結構等信息。導人IRW及Mimics等軟體均能進行各種量化分析。

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討論

本研究通過下支持帶動脈顯微灌注，成功地對12例離體豬股骨頭標本進行骨內血管灌注，顯微CT掃描，血管三維重建。證實了灌注離體豬股骨頭標本的可行性。從血運的角度觀察並量化骨量及骨結構與血管的關係。本研究主要討論離體豬股骨頭標本顯微血管灌注技術方法的可行性，以期探索一種能灌注離體股骨頭標本、進行血管定量研究的技術方法。由於本研究樣本數較少，未對其血管分布規律進一步與人體股骨頭內血管三維分布情況進行比較研究^[2]。

顯微鏡輔助，下支持帶動脈血管顯微灌注造影結合顯微CT掃描，血管三維重建能較好的觀察離體狀態的豬股骨頭骨內動脈血管分布情況，能對其進行定量研究，下一步可以將其運用於股骨頭相關疾病或模型動物股骨頭骨內血管定量研究中。

3.1 股骨頭骨內血管顯微灌注研究的意義

股骨頭壞死後支持帶動脈的血運對股骨頭骨內組織保持活力具有重要的意義，參與骨壞死、骨吸收、新骨形成以及骨重建等骨壞死的各個病理變化過程，有重要的作用，血液供應是關鍵的因素[6]。所以定量研究骨與骨內血管之間的解剖結構以及功能狀態的關係非常重要。目前臨床上對人的股骨頭血運研究技術方法有增強CT掃描，超選擇性DSA血管造影，增強核磁共振^[7，8]。受技術手段及解析度的限制。臨床上均不能很好的顯示股骨頭骨內血管。尚不能很準確的對股骨頭骨內血運進行定量研究。傳統的血管灌注或者血管鑄型研究技術主要針對正常屍體標本大血管進行灌注研究，要求灌註標本完整^[9~11]。成功進行離體豬股骨頭標本灌注的技術方法，有望為精確評估各組支持帶動脈對股骨頭血液供應所佔比例提供借鑒。也可用於研究模型動物股骨頭相關疾病進行股骨頭骨內血管定量研究而不必處死動物，可以多次使用同一動物進行聯合實驗研究節約成本。

3.2 研究方法的優缺點

目前有多種骨內血管造影的方法，其中最常用的方法是應用硫酸鋇或氧化鉛造影劑灌注，然後製成切片進行二維觀察，其操作簡便，可以灌注骨內微血管，但只能進行二維觀察，須先對股骨頭標本進行脫鈣，然後才能夠去除骨的影響而顯示骨內微血管^[12]。血管鑄型掃描電鏡的研究方法主要針對動靜脈血管微循環結構，需先將軟組織去除，然後將骨組織浸泡於軟化液再進行冷凍乾燥，雖然可以實現血管的三維顯示，而且通過電鏡可以獲得高精度的圖像，但是獲得是電鏡掃描的二維圖像，進行圖像量化分析困難，沒有骨礦物量的信息，操作步驟複雜，耗時很長，操作過程中對骨組織具有破壞。以硫酸鋇通過股動脈進行血管造影早已應用於正常屍體標本的股骨頭灌注，但由於離體股骨頭標本周圍軟組織結構較少，供應骨內血管直徑較小。因此，在顯微鏡下找到支持帶動脈並對細小支持帶動脈插管、結紮、灌注是成功的關鍵。前期需進行顯微外科器械使用訓練和顯微鏡下尋找血管訓練等實踐操作。顯微鏡輔助下對離體的豬股骨頭標本進行顯微灌注及骨內動脈顯微掃描，血管三維重建並進行各血管參數定量研究需要一定的顯微外科基本功。由於血管直徑較小、血管可活動性範圍有限，整個灌注操作過程需小心、細緻。納米硫酸鋇僅能顯示細小動脈，不能通過微循環，不能顯示微循環和靜脈系統。因此，探索一種能同時兼顧骨內「動脈一微循環一靜脈」的技術方法將是未來方向。

應用顯微CT進行高解析度掃描，血管三維重建，可以對微血管在三維空間內任意視角觀察，可對其定量研究。硫酸鋇造影劑血管灌注對於組織形態學觀察研究不會造成干擾，組織樣品經過顯微CT掃描後可以對其進行硬組織切片；或者固定、脫水、包埋、切片染色等組織學檢查；或者對組織標本進行生物力學檢測；若操作熟練，在較短時間內完成灌注，顯微CT掃描，尚可對組織進行分子生物學檢測。離體標本骨內血管顯微灌注成本低廉，骨內血管的改變對於研究骨疾病，骨壞死等有重要意義。本研究建立的豬離體股骨頭顯微灌注及骨內血管定量研究在股骨頭壞死和股骨頸骨折等股骨頭相關疾病領域有重要的價值，且較目前常用的血管透明技術等需要分割和脫鈣的骨內血管研究方法更簡便、快捷、可定量等優勢。

本研究不足：本研究樣本量較小，尚不能對豬股骨頭骨內血管的分布規律及形態特點進行相應的總結歸納，仍需進一步研究。

【參考文獻】略

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