分子標誌物監測肝細胞惡性轉化及肝癌早期診斷

文章來源：中華肝臟病雜誌, 2017,25(05): 325-328

作者：楊燕 姚敏 方淼 鄭文傑 董志珍 姚登福

摘要

如何監測肝細胞的惡性轉化或早期診斷原發性肝細胞癌(PHC)仍是醫學界的難題。常規的血清甲胎蛋白水平及B超檢查，對小肝癌診斷價值有限，然而PHC的有效治療取決於早期診斷。近來發現的PHC相關通路關鍵信號分子、癌胚型蛋白和非編碼RNA等分子標誌物，有助於監測肝細胞惡性轉化及肝癌的早期診斷。現綜述監測肝細胞惡性轉化及肝癌早期診斷有價值的分子標誌物。

原發性肝細胞癌( primary hepatocellular carcinoma，PHC)的早期診斷仍然是艱巨的醫學難題[1]。肝癌的發生、發展與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)和（或）丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)慢性持續性感染[2]、黃曲霉素及化學致癌物攝入、非酒精性脂肪性肝病等密切相關[3,4]。病原學因素致肝細胞抑癌基因功能喪失或促癌基因表達上調、癌胚型蛋白和促癌相關信號通路激活等誘發肝細胞惡性轉化，在慢性肝病進展為肝癌過程中加之肝組織微環境缺氧，出現相關信號通路關鍵分子、癌胚蛋白、非編碼RNA和新血管生成因子等表達改變，為PHC早期診斷奠定了分子基礎[5,6]。已報道的與肝癌診斷相關的標誌物眾多，單純以血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）或肝癌特異性AFP(AFP-L3)診斷肝癌已難以滿足臨床需要，其靈敏度和特異度均難令人滿意[7,8]。如何準確監測及特異診斷PHC，對治療極其重要。

一、癌胚型Wnt3a異常與PHC特異診斷

Wnt信號通路有19種分泌性蛋白，經自分泌或旁分泌方式與細胞膜上FZD受體結合傳遞信號，其中Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt-10a和Wnt-10b在Wnt經典途徑中發揮作用[9]。如Wnt3a為重要調節分子，於胚胎早期激活促進細胞增殖和分化，成人肝組織Wnt3a失活或低表達。Wnt3a受上游硫酸酯酶-2和磷脂醯肌醇蛋白多糖-3（glypican-3，GPC-3）調控與激活，促進肝細胞發生惡性轉化與肝癌的發生、發展。

1．肝癌組織Wnt3a：

以組織晶元、免疫組織化學法檢測自身配對的80例人肝癌及癌周組織中Wnt3a表達水平，結合隨訪數據評估其預後價值。結果顯示：癌組織Wnt3a主要定位於細胞膜和細胞質中，陽性率96.3%，顯著高於自身對照的癌周組的48.8%；癌組Wnt3a過表達佔71.3%，癌旁組僅為13.8%；Wnt3a高表達與分化等級、肝硬化、HBV感染、TNM分期和患者5年生存率顯著相關；COX分析和Kaplan–Meier生存曲線，分別顯示Wnt3a過表達是HCC預後的獨立預測因素，表明癌胚性Wnt3a異常表達是PHC早期診斷的潛在標誌物[10]。

2．外周血Wnt3a：

對80例HBV感染相關肝癌、53例肝硬化、53例慢性肝炎患者血清，並以40例健康獻血員的血清作為對照，評估血清Wnt3a的臨床診斷價值。結果顯示肝癌患者血清Wnt3a水平顯著高於良性肝病組；Wnt3a的表達與AFP水平、肝硬化、HBV感染、低分化、TNM分期和肝外轉移顯著相關；若以800 ng/L為正常上限，診斷肝癌的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.5%、94.3%、93.2%、96.1%和89.3%，與AFP聯合檢查診斷靈敏度達96.3%；診斷效率受試者工作曲線(ROC)下面積為0.994，高於AFP的0.710；各期肝癌組織中Wnt3a陽性率均較高，這顯示Wnt3a表達與肝癌進展相關，提示其為肝癌診斷與鑒別的有用標誌物[11]。

二、癌胚型GPC-3表達與PHC診斷

位於Wnt信號通路上游的GPC-3，促進Wnt蛋白與受體蛋白FZD結合，激活Wnt信號通路，同時與Patched (Ptch)競爭結合Hh，阻斷信號觸發器Ptch與Smoothened結合，致Hh內吞和降解，而抑制Hh信號通路，促進肝細胞的惡性轉化[12,13,14]。

1．肝癌組織GPC-3：

正常肝組織GPC-3無表達，胎肝及癌組織GPC-3高表達；肝細胞惡性轉化動態模型顯示在基因轉錄水平，GPC-3呈進行性增高表達，肝細胞變性組為83.3%，癌前病變組和癌變組均為100%[15]。癌組GPC-3表達與腫瘤分化程度、數目、HBV感染間未見明顯相關性，與腫瘤大小顯著相關，

2．GPC-3鑒別良、惡性肝病：

在鼠肝癌變過程中，對照組外周血GPC-3未見表達，在變性組、癌前組和癌變組中表達率分別為38.9%、66.7%和77.8%。PHC患者血中出現GPC-3表達，濃度0～4 000 ng/ml。慢性肝炎、原發性膽管細胞癌、轉移性肝癌和正常人血中均未檢測到GPC-3表達。肝癌患者血清GPC-3水平與患者的性別、年齡、AFP水平、腫瘤數目、肝功能Child-Pugh分級、門靜脈癌栓與否和肝外轉移間未見明顯關係。然而在肝癌

3．GPC-3 mRNA與肝癌診斷及轉移監測：

正常人、非肝腫瘤、肝炎、肝硬化及轉移性肝癌（非肝細胞來源）患者外周血GPC-3 mRNA均未見陽性表達；而55例肝細胞癌患者有39例表達，陽性率為70.9%。血清GPC-3 mRNA檢出率與TNM分期、門靜脈癌栓及肝外轉移顯著相關，而與腫瘤直徑、數目及分化程度無明顯相關；轉移性肝癌患者GPC-3 mRNA陽性率為100%。與非轉移組相比，轉移組GPC-3 mRNA表達率是非轉移組的5倍，說明循環血液GPC-3mRNA既可診斷肝癌，又可監測PHC的轉移發生[15,17]。

三、分泌型聚集素異常與肝癌診斷

高爾基體分泌的聚集素(clusterin, CLU)分布廣泛，CLU分為促進凋亡的核型聚集素(nuclear CLU, nCLU)和抗凋亡的分泌型聚集素(secretory CLU, sCLU)兩種亞型。sCLU定位於8號染色體(8p21-p12)，為單拷貝基因，種屬間高度保守，由1 651個核苷酸組成，其表達與肝癌進展、多葯耐葯（MDR）和癌細胞侵襲、轉移等相關[18]。

1．肝癌組織sCLU異常表達：

正常肝組織sCLU低表達，肝癌組織過表達與癌細胞增殖、侵襲和轉移相關。肝組織中sCLU主要定位於細胞質，癌組織過表達，癌旁組織低表達；癌組陽性率為77.3%，明顯高於癌旁組的36.1%；與淋巴結轉移、TNM分期、組織分化程度、Child-Pugh分級及患者生存時間密切相關。肝癌細胞中sCLU過表達，其水平與MDR1/P-gp呈正相關，激活Akt磷酸化增加HCC細胞對奧沙利鉑的耐藥性；採用小干擾RNA抑制sCLU，可逆轉肝癌細胞對吉西他濱的耐藥性，減弱肝癌細胞的侵襲力，提示肝sCLU過表達具有癌胚性作用[19]。

2．外周血sCLU：

肝癌細胞合成sCLU後直接分泌入血，致血sCLU水平增高。對良、惡性肝病患者外周血sCLU的定量分析，顯示PHC患者血清sCLU平均水平為120.1 μg/ml，明顯高於肝硬化的97.8 μg/ml、慢性肝炎的106.3 μg/ml及正常對照的90.0 μg/ml；ROC面積sCLU為0.771，AFP為0.750；診斷HCC陽性率sCLU為82.4%，明顯高於同批血清AFP的陽性率63.2%，但兩者具有互補診斷價值，聯合檢查，診斷陽性率可提高至93.1%，提示血清sCLU水平異常有助於肝癌診斷和良、惡性肝病的鑒別[20]。

四、膜聯蛋白(Annexin，ANX)A2異常與肝癌診斷

ANXA2具有RNA結合特性，與DNA合成、複製有關。肝組織ANXA2表達異常與PHC發生、發展關係密切，如介導凋亡、誘導分化等[21,22]。

1．肝癌細胞ANXA2表達：

癌及自身配對癌旁和遠癌組織ANXA2表達呈梯度下降；ANXA2在PHC癌組織中定位於胞質和胞膜，癌旁組織中定位於胞質，而遠癌組織中未見明顯表達。ANXA2表達上調意味著遠端轉移和不良預後。肝癌高侵襲潛能MHCC97-H細胞中ANXA2的表達，明顯強於肝癌HepG2、SMMC-7721和SMMC-7402；80%以上ANXA2可被特異性shRNA沉默，在免疫熒光顯微鏡下，ANXA2定位於細胞膜和細胞質，胞核少見；下調ANXA2表達致PHC細胞S期比例下降，癌細胞增殖抑制率為44.2%，侵襲抑制率為39.5%，遷移抑制率為36.5%，體內移植瘤模型顯示裸鼠皮下腫瘤生長抑制率為38.2%。表明ANXA2參與肝細胞癌變和PHC發展，可作為肝癌診斷標誌物[23]。

2．外周血ANXA2表達：

PHC患者的血清ANXA2表達水平明顯高於肝硬化、慢性肝炎、急性肝炎或健康人群，但與轉移性肝癌組間未見明顯差異。如以≥18 ng/ml為界，血清ANXA2在PHC組陽性率為87.0%，轉移性肝癌組陽性率為80%，肝硬化組陽性率為31.6%，慢性肝炎、急性肝炎或健康組都沒有陽性表達。ANXA2的ROC曲線下面積0.903，而AFP為0.823。外周血ANXA2與AFP聯合檢查靈敏度提高至96.5%，陰性預測值達到96.6%，準確性達到80.1%。ANXA2過表達與HBV感染、肝外轉移、門靜脈癌栓、中低程度分化和TNM分期相關，未見與患者性別、年齡、腫瘤大小和血清AFP水平等因素有明顯相關性[23,24]。

五、非編碼RNA與肝癌診斷

非編碼RNA包括具有調控功能的RNAs和管家性RNA。具有調控功能的RNAs按其在肝癌進展中的作用，可分為致癌性和抑癌性RNAs，如微小RNA (microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(longnon-coding RNA, LncRNA)、siRNA和piRNA，參與胚胎髮育，細胞增殖、分化和凋亡等過程，轉錄後可調節相關基因表達，在幹細胞分化、新血管生成、癌細胞浸潤與轉移過程中發揮作用[25,26]。

1．miRNA：

由22～24個核苷酸組成的超過1 000種非編碼miRNA，可分為致癌性miRNA和抑癌性miRNA。正常肝組織表達抑癌性miRNAs，其作用類似於抑癌基因，如miR-122、miR-126和miR-375等[27,28]。外周血及組織miRNAs，如p53、p21、c-Myc和STAT3等，在肝癌發生中起關鍵作用。儘管有多種miRNAs能用於肝癌診斷，但均為廣譜性腫瘤標誌物且陽性率差異頗大，對診斷缺乏特異性。

2．LncRNA：

LncRNA分為基因內、基因間、正義、反義和雙向LncRNA。肝臟促癌lncRNA和抑癌lncRNA共同參與細胞增殖和分化調節，處於平衡狀態。HBV和HCV感染可破壞平衡，出現肝炎病毒感染特異的lncRNA：如HBV相關的PCAT-29、與HCV相關的aHIF和PAR5，與丁型肝炎病毒相關HCC則為Y3，而BC017743、BC043430和LINCO1152三種LncRNA則為不同致病因素肝癌所表達。HCC患者血清lncRNA-uc003wbd和lncRNA-AF085935明顯高於健康組，ROC下面積分別為0.96和0.86。與正常對照組相比，lncRNA termed TCF7在肝硬化組正常，癌旁及癌組織分別增高5倍、100倍。提示lncRNA或某些特異型lncRNA為肝癌診斷的新標誌物[29]；但有待大樣本的臨床研究。

六、展望

綜上所述，儘管肝癌早期準確診斷的相關標誌物研究已取得顯著進步，Wnt信號通路關鍵分子Wnt3a、高爾基體分泌的sCLU、GPC-3及ANXA2水平異常，有助於肝癌診斷和良、惡性肝病的鑒別；但臨床應用亟待解決問題仍較多。特異分子標誌物除診斷外，如以此為靶點治療，聯合手術、介入、化療或放療等，可改善患者療效，延長患者生存時間[30]。

參考文獻（略）

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