發酵工程師進階：微載體培養技術的研究進展

摘要

荷蘭學者van Wezel[1] 於1967 年首先創立了微載體培養動物細胞技術。在微球表面培養細胞可以在較短時間內得到大量的細胞，且細胞傳代只需要添加新的微載體，基本上可避免細胞在胰酶消化過程中受到的損傷，因此微載體培養細胞技術是非常方便和有意義的。微載體之所以能成為目前最常用、最有效的動物細胞培養載體，是因為許多病毒疫苗和重組蛋白須在貼壁依賴型細胞系生產，而微載體具有比表面積大、易檢測、易控制培養系統環境因素、培養基利用率高、可實現無細胞過濾、污染少等特點，更接近體內三維立體環境，細胞易於在其上生長。

本文引用的文章

1、周燕《微載體培養技術的研究與進展》

2、魏鳳《微載體技術在動物細胞培養中的應用進展》

3、郭燕華《微載體培養技術的研究進展》

4、沈武玲《微載體培養技術在生物醫藥領域的應用》

微載體特點

微載體是指直徑在60 ～ 250 μm，適用於貼壁依賴型細胞生長的微珠。微載體能成為迄今最常用、最有效的動物細胞培養載體，各類微載體共同具有的優點: 比表面積大; 易於檢測和控制培養系統環境因素和微珠上細胞的生長情況; 培養基利用率高; 可實現無細胞過濾，優化下游工程; 培養放大容易，勞動強度大，可系統化、自動化，減少污染; 提供了更近於體內環境的三維立體環境，細胞在微載體上可克服接觸抑制，形成多層生長。

微載體分類

目前，在實際中應用廣泛的是固體微載體，包括實心球體微載體和大孔微載體。實心微載體易於細胞在微珠表面的貼壁、鋪展，病毒生產時的細胞感染，放大過程中球轉球接種工藝,實心微珠相對於利用 微珠內部來培養細胞的大孔微載體比表面積和可獲 得的細胞濃度較小，細胞易受攪拌、珠間碰撞、流動剪 切力等動力學因素破壞。大孔微載體可廣泛用於填充床、流化床、攪拌釜生化反應器，且在灌流反應器中可保持數月的良好生產力，能在降低培養基血清含量的同時保證細胞和目的產物的產量; 但它在空間上阻礙了氧等營養成分的傳遞和病毒的感染細胞，積累代謝廢物

微載體的改性

微載體須具有細胞易於黏附的表面，因而在製作微載體時必須考慮其表面親水性及電荷特性。常用的改性方法有化學改性法、等離子體法和表面修飾法等。化學改性法是指通過共聚、接枝等方法來改變材料的組成，同時獲得具有良好細胞親和性表面的方法。等離子體改性法是指在微載體表面引入特定的官能團或其他高分子鏈。表面修飾法是指在微載體表面固定一些貼壁因子、多聚賴氨酸、膠原蛋白等，以提高細胞的黏附性。

微載體的類型

國際市場上出售的微載體商品的類型已經達十幾種以上,包括液體微載體、大孔明膠微體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。

微載體種類

大部分細胞是貼壁依賴型細胞，只有黏附在固體基質表面才能增殖，因此細胞貼附於微載體表面是細胞生長的關鍵。影響細胞貼附和鋪展的主要因素是二價陽離子和吸附糖蛋白，其他影響因素有粒徑、表面光滑程度、與細胞分離難易程度、重複使用性等。就製造材料而言，微載體可分為葡聚糖微載體、聚苯乙烯微載體、中空玻璃微載體、交聯明膠微載體、纖維素微載體、聚苯烯酞胺微載體、殼聚糖微載體等; 就物理性質而言，微載體可分為固體微載體和液體微載體，固體微載體較為常見，又可分為實心微載體和大孔或多孔微載體。實心微載體易使細胞在微球表面貼壁、鋪展和病毒生產時感染。

微載體的性能要求

組織工程種子細胞主要為貼壁依賴性細胞，其只有黏附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。影響細胞貼附和鋪展的主要因素是二價陽離子和吸附糖蛋白。除上述兩因素外，對粒徑、表面光滑程度、與細胞分離難易、重複使用性等方面均有要求。

微載體培養技術

在病毒疫苗研究領域的應用

1987年Vero 細胞成為WHO 和我國生物製品規程認可的、並可廣泛應用於病毒疫苗生產的細胞基質，而且該細胞系對狂犬病病毒、流行性乙型腦炎病毒、脊髓灰質炎病毒、流感病毒、腎綜合征出血熱病毒、甲型肝炎病毒、呼腸病毒病毒等多種病毒均敏感，在相關疫苗研發和生產中得到應用。國內外關於Vero 細胞微載體培養的報道較多。如：Baxter 公司以Cytodex － 3 微載體無血清培養Vero 細胞生產H5N1 禽流感疫苗( CELVAPAN) 的規模已放大到6 000 L 生物反應器，生產能力達到2 億人份/年。

基因工程藥物研究領域的應用

20 世紀70 年代，隨著DNA 重組技術的成熟，誕生了基因工程藥物。目前基因工程藥物已經歷了3 個階段: ( 1) 將藥用蛋白基因導入大腸桿菌等細菌中，通過大腸桿菌等表達藥用蛋白，但這類藥物往往有缺陷，人類基因在低等生物細菌中往往不表達或表達的蛋白沒有生物活性。( 2) 用哺乳動物細胞代替細菌生產第2 代基因工程藥物。( 3) 20 世紀80 年代中期，隨著基因重組和基因轉移技術的發展和完善，科學家可以將人類所需藥用蛋白基因導入哺乳動物體內，使目的基因在哺乳動物上表達，從而獲得藥用蛋白。

基因藥物的大規模製備依賴於細胞的懸浮培養，而大部分動物細胞都是貼壁型，微載體培養技術能實現動物細胞表達系統( 如CHO、昆蟲細胞等) 大規模懸浮培養，從而生產大量干擾素、單克隆抗體等，該方法具有培養周期長、表達產物產量高、產物易純化等特點

在組織工程領域的應用

目前應用微載體系統進行組織工程種子細胞大規模培養受到青睞，有關研究進展較多，尤其是在骨髓基質細胞、軟骨細胞、肝細胞、成纖維細胞、髓間充質幹細胞、生肌細胞等研究領域已經取得階段性成果。肝臟是臟器再造領域研究最早的臟器之一，20 世紀90 年代初期國外科研人員就開展了大量的肝細胞大規模培養研究。微載體肝細胞培養法的主要優點在於可增大培養面積，明顯提高肝細胞培養密度( 1 × 1010 個/L) 。

微載體大規模細胞培養的生物反應器系統

攪拌式生物反應器系統

最簡單的生物反應器系統即為攪拌式生物反應

器系統。該系統在旋轉培養瓶的瓶底放置磁力攪拌棒，通過磁力攪拌使微載體在培養基中基本上達到均勻分布。在微載體大規模細胞擴增研究領域的應用中，攪拌式生物反應器系統已有較長的歷史，但因該細胞培養系統容易產生過大的剪切力，從而限制了其應用範圍。儘管如此，由於該系統具有簡單、實用及價格低等特點，應用該系統進行組織工程種子細胞大規模擴增國內外已有不少成功的報道。

灌注式生物反應器系統

攪拌式生物反應器系統儘管存在很多優點，但機械攪拌會帶來不需要的剪切力。為了消除這種不利因素，國外常採用灌注式生物反應器系統來進行微載體大規模細胞培養研究。灌注培養是目前細胞工程領域研究的熱點之一，它的特點是不斷地加入新鮮培養基，以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養基，使細胞在一個相對穩定的生長環境內增殖，既省時省力，又減少了細胞被污染的機會，且可以提高細胞密度10 倍以上。

旋轉生物反應器系統( RCCS)

近年來，RCCS 已成為應用微載體技術進行細胞大規模擴增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基於美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。RCCS 既可以用於微載體大規模細胞培養，又能在其內培育細胞與支架形成的三維空間複合體。該反應器是將細胞種植到微載體後，將其移入RCCS 圓柱狀的培養容器內，加滿培養液。整個容器由於電機驅動沿水平軸旋轉，細胞微載體顆粒在水平軸內建立均質的液體懸浮軌道，並隨容器一起旋轉且不與容器壁和其他物體相撞。由於系統無推進器、氣泡或攪拌器，所以破壞性應力減到最小。在RCCS 中，細胞通過膜式氣體交換器來吸氧和排出CO2。由於該系統可提供破壞性應力很低的細胞生存環境，因此近年來已經廣泛應用於微載體系統大規模細胞培養研究，至今已有近百種組織細胞在該系統內成功進行了大規模擴增。

研究的方向

目前微載體研究仍有以下幾方面問題須要解決: 研製適合多細胞生長的新型微載體; 研發剪切力小、混合性能好的新型培養系統; 研發無血清培養基; 解決微載體培養過程中的結團問題，創新擴大培養的傳代方法。

新型微載體要兼備材料學和生物學的特性。綜上所述微載體材料仍以合成聚合物居多。這種微載體重複性和力學性能可以達到較高水平，但缺乏細胞識別位點，影響細胞在其表面的黏附、生長。天然聚合物則能彌補這一缺點。殼聚糖因其良好的生物學性能成為製備材料首選。

走過路過，不要錯過這個公眾號哦！

GIF/1K

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！