Nature：擬南芥微生物組功能研究3人工重組微生物群落

背景介紹

Bai, Y., et al. (2015). 「Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.」 Nature 528(7582): 364-369.

本文是2015末發表在Nature的Article文章，第一作者為白洋，主要負責擬南芥根相關菌分離、培養、測序和人工重組實驗，現中科院遺傳發育所研究員；共一的第四作者Ruben Garrido-Oter，主要負責細菌鑒定、基因組和擴增子分析，現馬普植物育種所Group Leader。通訊作者分別為德國馬普植物育種所的Paul Schulze-Lefert教授和瑞士蘇黎士微生物所的Julia A. Vorholt教授。

由於本文內容極多，分為四篇文章進行介紹：

0概述

1細菌分離培養鑒定

2細菌基因組測序和分析

3人工重組微生物群落

本文是此系列的最後一篇：3人工重組微生物群落

人工重組細菌群落

本研究並不是關注差異丰度菌的具體功能，更多關注人工重組細菌群落的不同來源、不同組合方式、不同接種方式下細菌群落重新定殖後形成的結果。對所有的人工重組菌群研究，均有一定的示範和指導意義。

主要採用葉、根和土壤來源分離的純菌，組成人工重組微生物群落對擬南芥進行再定殖。研究中採用的培養基質是一種鈣化土(Calcined clay)，是用於鋪棒球場的材料。

無菌體系培養基質的選擇？

在目前來看，無菌小鼠的研究已經非常多植物不動，應該更好培養才對呀，但無菌植物的報導卻非常少。這主要包括兩方面原因，第一是植物研究確實落後於動物研究；其次是植物生活在土中裡面全是微生物。

大家都想到了給土壤滅菌，但末發表的結果表明，不論是高溫滅菌，還是輻射滅菌；土壤都不再適合植物生長了，估計是發生了化學變化，產生了不利於植物生長的毒素。這種現象有點像過火的森林，或核爆後的土地，是需要時間進行修復，才能再生長植物的。

另一種方法是在MS固體培養基中生長，確實可行，但存在兩方面問題：理化性質和結構與土壤差別實在太大；有種植成功者也表示擬南芥結實困難(可能是濕度過大？)。

實驗的具體操作步驟

原文為方法部分「Recolonization experiments of leaf-, root- and soil-derived bacteria on

Arabidopsis」。我簡要的翻譯如下：

實驗方法：

鈣化土用水洗乾淨，並用高壓蒸汽滅菌兩次，並在烘箱中徹底乾燥(注意用牛皮紙密封保持無菌)；

擬南芥種子表面乙醇消毒，並4攝氏度過夜春化；

葉、根和土中分離的菌，採用96深孔培養板搖菌，並隨後用等體積，或非等體積方式混合，用於構建人工合成的細菌群體(bacterial communities, SynComs), 用於後續實驗的接種。

混合菌液調成OD600為0.5時，濃度大約為2.75x10^8個細胞/mL；根據實驗設計取1 ml菌液，添加至70ml 1/2 MS培養基(pH7，包含維生素但不加糖)，並與100克鈣化土在組培瓶(Magenta box)中混勻，這時每克土含有2.75x10^6個細菌，然後直接種植擬南芥種子；

植物生長在22攝氏度，11小時光照，54%的溫度。

7周後，植物根勻漿的細菌濃度達1.4x10^8個細胞每克根組織。

採用葉表噴施接種的植物，上述混菌的濃度調為OD600條件下0.2值，並再稀釋10倍後，在植物4周時，取170 ul使用TLC層析試劑噴霧器，噴施每個組培瓶。每次噴施的量可以通過向50 ml管中反覆噴後稱重計算；

所有無苗的對照，也進行同樣操作，並在7周後無菌環境下取樣。

樣品收穫時，無菌環境下使用無菌鑷子和剪刀取葉和根，防止交叉污染；凡接觸土的葉子要去除；

每盒中的地上和地下分別保存於MP的取樣管中，用於接下來的提取DNA；

人工重組微生物群落的Beta多樣性分析

Extended Data Figure 8 箱線圖展示無菌擬南芥人工重組群落實驗結果的Beta多樣性。圖中展示不同組內或組間的距離，可以看到在植物的根、葉和土壤中形成的群落與接種時有非常大的變化(a)；而且形成的根、葉和土間也存在極大的差別(b)；採用噴施接種也得到同樣的結果(c/d)。

人工重組微生物群落與自然群體丰度比較

Extended Data Figure 9 箱線圖展示無菌擬南芥人工重組群落在根和葉中門、目和科水平上主要分類級別的丰度差別。我理解為人工重組群落可以比較好的重現自然群落的組成與結構。

葉/根特異OTU重組競爭形成組織特異的群落

Extended Data Figure 10 不同接種方式下形成群落結構表明器官形成特異的群落結構。結果表明根、葉中存在大部分相似的細菌種類，但還是存在明顯特異的細菌和特異的群落結構。

Clay中接種根和土分離菌後群落結構

Supplementary Figure 2 熱圖展示無菌植物接種根和土分離菌後，在土、根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。a/b為不同的起始接種菌比例。

結論：不同接種起始濃度對結果影響不大，會自發形成一定形態的群落結果。

葉片噴施葉來源菌後的群落結構

Supplementary Figure 3 熱圖展示無菌植物噴施接種葉片分離菌後，在根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。a/b為不同的起始接種菌比例。

Clay中接種根、葉和土分離菌後群落結構

Supplementary Figure 4 熱圖展示無菌植物Clay中接種根、葉和土分離菌後，在土、根和葉中形成群落中各成分的丰度。

葉分離菌接種Clay後群落結構

Supplementary Figure 5 熱圖展示無菌植物葉分離菌接種於Clay，在根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。a/b為不同的起始接種菌比例。

比較自然群體和人工重組群落不同接種方式下形成的群落結構

Supplementary Figure 6 箱線圖展示自然群體、Clay+噴接種、Caly接種後形成的群落結構

結論：不同接種方式，對最後群落結構還是存在一定影響，存在一些顯著差異的種類，如Chryseobacterium, Sphingomonas and Variovorax

Clay+噴所有菌後群落結構

Supplementary Figure 7 熱圖展示無菌植物分離菌接種於Clay，並於15天時噴L片來源菌，在根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。a/b為不同的起始接種菌比例。

Clay只接根來源菌後群落結構

Supplementary Figure 8 熱圖展示無菌植物只接種根分離菌接種於Clay，在Clay、根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。

根來源菌噴施後群落結構

Supplementary Figure 9 熱圖展示無菌植物只噴施接種根分離菌，在Clay、根和葉中形成群落中各成分的丰度分布。

寫在後面

由於文章內容過多，我理解能力和講解也有限。有相關研究的，大家要仔細看原文，研究實驗設計，更清楚如何應用在自己的實驗。

更多人工重組方面的研究，推薦閱讀Dangle近期的Nature文章《Root microbiota drive direct integration of phosphate stress and immunity》。

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