基迪奧合作客戶環狀RNA高分文章發表！

2017年3月以來Cell Research、Molecular Cell等雜誌接連報道了3篇內源性circRNA可以翻譯蛋白質的研究，但對翻譯的新蛋白生物學功能和分子調控機制仍不清楚。

8月29日，中山大學附屬第一醫院神經外科張弩副教授團隊在國際頂級學術期刊美國國家癌症研究所雜誌JNCI（Journal of the National Cancer Institute，IF2016= 12.589）發表題為「Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis」的論文，在國際上首次證實circ-FBXW7可以翻譯一種抑制膠質瘤的全新蛋白質，並用功能學實驗證明了新蛋白的分子機制，在腫瘤circRNA研究中具有里程碑意義！

基迪奧有幸參與該項目，配合完成了circRNA的高通量測序和生物信息學分析，準確鑒定和篩選了神經膠質瘤相關的circRNAs，並且出色完成客戶的個性化分析和定製化圖表的繪製，為後續功能學驗證打好基礎。

那麼作為一篇以測序為基礎，多種功能學實驗結合的高分文章，究竟有哪些值得借鑒的思路和方法呢？下面我們為大家一一解讀，重點講解以下三點：

如何篩選和確定目標circRNA分子？

如何推測和證實circRNA翻譯蛋白質？

如何研究circRNA翻譯蛋白質的生物學機制？

發表期刊：《JNCI J Natl Cancer Inst》[1]

影響因子：12.589

研究背景

最近研究表明circRNA在發育，基因調控和癌症發生髮展過程中發揮著重要作用，但circRNA直接編碼蛋白髮揮生物學功能的報道還很少，相關研究還有很大的空白。

研究思路

研究結果

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circRNA高通量測序和差異表達研究

對腦膠質瘤臨床組織標本進行circRNA深度測序及生物信息學分析挖掘，得到下機數據後，首先將會對其進行過濾，得到HQ Clean Reads。每個樣品的 HQ Clean Reads利用Botiwe2和TopHat分別與核糖體序列和參考基因組比對，從比對結果中提取Unmapped Reads，然後截取每一條Unmapped Reads的兩端（默認20bp），得到Anchors Reads。用Anchors Reads再一次比對到基因組上，將得到的比對結果提交給find_circ軟體鑒定出環狀RNA。

總共發現了31145個circRNAs，其中6442個已經收錄在circbase資料庫中。大多數circRNAs（18399個）來源與外顯子區域，其它來源於內含子，5』-UTR, 3』-UTR區域或者antisense sequences。絕大多數circRNAs的長度小於1500bp，其中小於500bp的數量最多。癌和癌旁中circRNAs的染色體分布沒有明顯差異，但是癌組織中circRNA整體表達丰度低於正常組（圖1）。

圖1. CircRNAs測序信息統計

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篩選和確定目標circ-FBXW7分子

首先，通過上述circRNA深度測序及生物信息學分析挖掘，發現了一些在腦組織以及癌旁組織中有明顯表達差異的circRNAs。

其次，作者關注了著名的抑癌基因FBXW7基因的第3、4外顯子環化後形成一個620 nt的環狀RNA，並命名為circ-FBXW7。

最後，作者根據circRNADb在線資料庫檢索了一下，發現此資料庫收錄了FBXW7基因對應的一個circRNA跨越基因組長度1227bp的分子，剪接的成熟體circRNA是620nt，和本研究報道的吻合，暗示著circ-FBXW7可能具備蛋白編碼的潛能（圖2）。綜合以上特點，作者將研究目標鎖定為circ-FBXW7，是整篇文章的基石。

圖2. CircRNA差異表達和候選基因的篩選

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功能學驗證circ-FBXW7的環狀大小和結構

為了證明circ-FBXW7來源於host gene的3，4外顯子，作者設計特異性引物，利用qPCR發現cDNA中有環狀預期的片段，並且抵抗RNase R的消化；此外，gDNA沒有預期的片段，證明circ-FBXW7為環狀RNA的可靠性。Sanger測序驗證環化接頭位點的序列；此外還通過構建circRNA表達載體驗證了circ-FBXW7長度為620nt，不同於circbase中的1227nt，作者推測這是circRNA內部存在可變剪切有關（圖3）。

圖3. Circ-FBXW7的環狀結構的功能性驗證

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Circ-FBXW7的編碼能力預測和功能性驗證

作者分析Circ-FBXW7的翻譯元件，首先，發現其存在一個編碼185 aa的開放閱讀框（ORF），並且具有物種間保守性暗示ORF的編碼潛力；其次，包含核糖體進入位點（IRES）序列，預示著具備基本的翻譯元件。 接著用雙熒光報告實驗證明Circ-FBXW7中的IRES的相關活性，具有引導5』帽子非依賴性翻譯的能力；Flag標籤表達載體證明Circ-FBXW7能夠在人類細胞中翻譯出相關蛋白；最後用LC-MS質譜技術證明翻譯的蛋白約為21KD，並命名為FBXW7-185aa。

圖4. Circ-FBXW7的編碼能力預測和功能性驗證

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circRNA翻譯的FBXW7-185aa蛋白在腫瘤中的生物學活性和分子機制

通過細胞功能試驗，作者發現FBXW7-185 aa蛋白能夠明顯抑制腫瘤細胞的增值。為了證明是FBXW7-185 aa蛋白髮揮功能而非Circ-FBXW7的作用，作者突變了IRES元件作為對照。IRES序列突變後，circRNA可以形成但是翻譯蛋白質就受到很大影響，這就證實FBXW7-185 aa蛋白而不是RNA發揮著直接的作用，也是文章的亮點。

根據已有研究報道，FBXW7基因作為一個E3泛素連接酶，通過泛素化途徑調控一大批癌基因的穩定性，包括著名的原癌基因c-Myc。FBXW7產生的蛋白FBXW7a能夠降低了c-Myc的穩定性。

作者首先證明circRNA翻譯的小蛋白FBXW7-185aa也能明顯降低c-Myc蛋白的表達，並證明FBXW7-185aa影響c-Myc的半衰期。通過IP和pulldown實驗證實FBXW7-185aa蛋白可以競爭性結合USP28，從而促進全長FBXW7產生的蛋白對c-Myc蛋白的泛素化降解，從而參與調控腫瘤生物學過程。因此，作者發現了FBXW7產生的蛋白和FBXW7-185aa協同作用調控c-Myc的有趣的調控模式。

圖5. FBXW7-185aa蛋白功能機制模式圖

研究總結

本文是一篇典型的高通量測序篩查目的基因，再通過完整的功能學實驗驗證的高分醫學文章，其關鍵點至少有以下幾個方面：

高通量測序的為研究者篩選了與膠質瘤顯著相關的circRNAs，這些差異表達的circRNAs可能都以各種方式參與了膠質瘤的發生髮展過程，為研究者提供了重要的候選分子儲備。因此，高通量測序為臨床分子機制研究提供了可靠的和豐富的組學候選分子。

作者在一批差異表達基因中毅然選擇了來源於抑癌明星分子FBXW7的circRNA作為研究對象，為整篇研究打好了基礎。首先，來源基因的功能可能直接影響形成的circRNA生物學特性；其次，候選circRNA在疾病組和對照組間顯著差異表達，很大幾率發揮著生物學功能；最後，候選circ-FBXW7含有完整的ORF和IRES翻譯元件，其編碼能力研究也是circRNA研究的重要方向。因此，基於以上考慮作者明智的選擇了目的基因，可以說是整個研究的關鍵。

circ-FBXW7的結構特性，根據已報道的circRNA翻譯文章，並非所有具備翻譯能力的circRNA都具有IRES，有些沒有IRES序列在m6A修飾下驅動翻譯[2]，有些具有類IRES功能的短序列（如circMbl cUTR）驅動非帽翻譯[3]，候選circ-FBXW7含有完整的ORF和IRES翻譯元件一方面更具有翻譯潛力，另一方面為IRES突變等功能學實驗帶來結構上的便利。

circRNA的翻譯能力的研究是前沿和新穎的，作者通過大量的體內和體外功能性實驗如免疫學和蛋白質譜等，得出了一系列直接的數據，證明了circRNA編碼的蛋白和其生物學功能。

作為腫瘤circRNA的第一篇蛋白翻譯的文章，它的意義在於揭示了circRNA除了通過miRNA sponge功能參與癌症功能外，circRNA還可以通過直接編碼的蛋白來影響癌症的生物學進程，打破了將circRNA定義為「非編碼RNA」的傳統認識，拓展了circRNA在腫瘤學中的研究領域。

基迪奧公司為客戶提供了優質全面的高通量測序和個性化生物信息服務，具有豐富的circRNA項目經驗，能為您提供：

專業的方案設計——個性化方案服務。

豐富的項目經驗——成熟的circRNA高通量研究和生物信息學分析，包括對組學circRNA數據的ORF預測等翻譯功能的研究。

可直接發表的內容展示——針對客戶定製化生物信息分析和個性化圖表繪製服務。

參考文獻：

[1] Yibing Yang, Xinya Gao, Maolei Zhang, Sheng Yan, Chengjun Sun, Feizhe Xiao, Nunu Huang, Xuesong Yang, Kun Zhao, Huangkai Zhou, Suyun Huang, Bo Xie, Nu Zhang (2017) Novel Role of FBX W7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.JNCI J Natl Cancer Inst. doi: 10.1093/jnci/djx166

[2] Yang Y, Fan X, Mao M, Song X, Wu P, Zhang Y, Jin Y, Yang Y, Chen L, Wang Y, Wong C C, Xiao X and Wang Z (2017). extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine.Cell Res. doi: 10.1038/cr.2017.31

[3] Pamudurti N R, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L, Hanan M, Wyler E, Perez-Hernandez D, Ramberger E, Shenzis S, Samson M, Dittmar G, Landthaler M, Chekulaeva M, Rajewsky N and Kadener S (2017). Translation of CircRNAs.Mol Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2017.02.021

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