精準醫學背景下先天性巨結腸的研究進展

先天性巨結腸（Hirschsprungdisease,HSCR） 是常見小兒消化道畸形，源自胚胎期神經嵴細胞（neural crest cells）發育障礙引起的遠端腸段腸神經系統（enteric nervous system,ENS） 缺失，全球發病率約1/5000，以亞洲人群發病率最高（28/10000）。

HSCR屬於一類致命性出生缺陷，其自然轉歸預後差，患兒表現為頑固性便秘，腹脹，生長發育遲緩，30%的患兒合併多種其他畸形(如先天性心臟病、中樞神經系統功能異常等)，6個月內死亡率達50%～70% 。 HSCR發病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害新生兒健康。 而在大數據的時代背景下，精準醫學將有助於我們在HSCR這類多基因複雜遺傳疾病的早期診斷及臨床干預中獲得實質性成果。 將精準醫學與先天性巨結腸研究相結合得益於近些年來技術層面的突破性進展，其中涵蓋了大數據科學、系統生物學、基因組學、生物標記物以及4P(Prediction，Prevention，Participation，Personalization) 醫學等諸多領域。 倘若依照不同目標人群，將HSCR解構為多重遺傳學及生物學意義上的子集，那麼便有可能形成一種行之有效的精準醫學分析策略，即根據個體生物學組成的不同而實現其治療方案的最優化。 在經歷了漫長而艱辛的臨床試驗歷程，在大數據時代的映襯下，精準醫學帶給我們的是生物醫學研究領域的一種嶄新模式，機遇與挑戰並存。

一、HSCR精準醫學模式

2015年1月20日，美國總統奧巴馬宣布斥資2.15億美元啟動精準醫學計劃(Precision Medicine Initiative)，旨在通過對100萬名志願者基因組信息進行系統分析，探索遺傳變異對人類健康及複雜疾病發病機制的影響，該計劃始於癌症研究領域，後期逐步擴展至其他相關疾病範疇。 事實上，將精準醫學應用於複雜疾病治療，即依據個體差異制定臨床干預方案，這一概念本身並不稀奇，一個多世紀以來，血型檢測一直被用來指導病人輸血，這也可以說是精準醫學的體現。 時至今日，繼4P醫學模式之後出現的精準醫學，其核心目標是依據患病個體遺傳背景、病理生理及臨床特徵的不同而調整治療方案，即根據個體的特定生物學組成(biologicalｍake up)制定相應的疾病干預措施。

鑒於先天性巨結腸本身的高度複雜性，期望以一種治療方案惠及所有患者的可能性非常小，而在諸如癌症、心血管疾病、神經退行性疾病等研究領域也面臨著同樣的問題。 因此目前的關鍵是如何將精準醫學付諸實踐，其首要任務是搭建起方法學框架，即利用系統生物學以整合探索性、多層次、多學科的體系方法。對於精準醫學而言，基因組測序技術無疑是最具影響力的方法學及技術層面的進步，其已經催生出多項腫瘤領域體外診斷(in vitrodiagnostics，IVDs)標準。 此外，隨著全基因組測序，全外顯子組測序，個體序列、拷貝數變異及結構重組掃描等方面的不斷進步，在未來5～10年，這些均有可能成為臨床檢測的常規化步驟。

同樣得益於基因組測序技術的不斷革新，先天性巨結腸研究領域也在經歷著由基因組醫學向精準醫學的轉變，人們逐漸認識到其在遺傳學意義上的複雜性。 作為一類經典的多因素遺傳模型，先天性巨結腸具有與其他複雜疾病相類似的遺傳特點，其中20%為家族性病例，其餘為散發病例，先天性巨結腸同胞之間的患病風險高達33%。HSCR家族性病例常表現為孟德爾遺傳模式，即具有顯、隱性遺傳特點，加之降低的外顯率，而對於散發病例而言，其遺傳模式則更為複雜，通常為非孟德爾式遺傳，且具有多基因相互作用模式、ｍ性別依賴性低外顯率等特點。以往HSCR相關性研究側重點主要圍繞著罕見家系樣本，而近期研究人員更多關注HSCR散發病例，同時結合case-control分析策略以尋找HSCR的主效致病基因。 到目前為止，已有包括RET、GDNF、NRG1等在內的15個基因被證實與先天性巨結腸的發病相關，然而即便如此，這些基因也僅能解釋約30%的HSCR病例，提示可能有其他基因與HSCR的致病風險相關。我們在以往的研究中發現，PTCH1(Patched1)基因的常見變異可能與中國漢族人群中HSCR患病風險的改變相關，並進一步證實遺傳多態性位點rs357565的C等位基因以及rs2236405的A等位基因均為先天性巨結腸的風險因子。 此外，PTCH1作為Hedge hog的結合受體，可能參與調控腸神經嵴細胞(en teric neural crest cells，ENCCs) 的 增 殖 及 分 化 過程。 目前有關先天性巨結腸的分子遺傳學研究，更多集中在單個基因及其相應的單核苷酸多態性位點( single nucleotide polyｍorphisｍs，SNPs)對HSCR發病風險的影響。 然而考慮到 HSCR本質上屬於多基因複雜遺傳疾病，深入挖掘其相關基因互作網路，也許可以幫助我們更全面剖析先天性巨結腸的遺傳特質。我們近期的研究第1次在中國漢族人群中證實GABRG2、RELN及PTCH1之間存在複雜的相互作用關係，且GABRG2-RELN-PTCH1互作網路可能進一步影響HSCR的遺傳易感性，提示基因互作網路可能在HSCR的發病機制中發揮重要作用。

隨著越來越多常見變異及易感位點被證實與HSCR發病風險相關，如何構建相應的多基因風險評估模型並將其應用於HSCR遺傳風險預測，是目前亟待解決的難題。 從精準醫學角度考慮， HSCR研究中需要根據患病個體的特定類型尋找相應的遺傳標記物，從而使其最終能夠受益於臨床靶向治療。

二、 精準醫學助推 HSCR分子診斷進程

1886年，丹麥兒科醫生Harald Hirschsprung首次描述了先天性巨結腸這一疾病，自此先天性巨結腸逐漸成為大量臨床及基礎研究的實驗對象。 隨後Swenson和Bill於1948年第1次採用手術治療先天性巨結腸，這對於我們理解HSCR發病機制具有里程碑式的意義。 將手術技術引入先天性巨結腸的治療，一方面極大提高了HSCR患者的存活率，另一方面，創造了條件，使得研究人員可以發現HSCR家族傳播的特性及其複雜遺傳疾病的本質。 此後，HSCR小鼠模型及家系研究均證實RET為先天性巨結腸發病的主要易感基因，而這與先天性巨結腸被發現已相隔一個多世紀，自此，大量遺傳突變被證實與先天性巨結腸的發病風險相關。

HSCR提供了一個非常好的模型用以研究精準醫學背景下分子診斷在臨床中應用的優勢及局限性。 隨著第二代測序技術( NGS，neｘt generation sequencing)的不斷革新，複雜疾病分子診斷過程中鑒別出大量的致病基因及突變，然而這些基因的突變表型可能遠比我們之前認為的要複雜。 事實上，究竟有多少基因影響HSCR的發病進程(或者改變HSCR的發病風險)，目前仍不得而知。 另一方面，已報道HSCR相關基因突變還可能通過相互作用而影響一個或多個信號通路，或者可能通過多重生物學機制影響疾病表型。 迄今為止，絕大多數與先天性巨結腸發病進程相關的易感基因大致可劃分為三類： ① 與RET活化信號通路相關(RET，GDNF，PSPN等)；②與EDNRB信號通路相關(EDNRB，EDN3，ECE-1等)；③作用於RET或EDNRB信號通 路 的 轉 錄 因 子 (SOX10，PHOX2B，ZFXH1B等)。相信在NGS的推動下，HSCR易感基因及其突變位點將會呈指數倍的增長，而其中有多少比例的遺傳突變真正具有臨床意義現在還是未知數。 此外，對於大多數致病性遺傳突變而言，目前的研究還無法完全解析其相關表型的複雜性。

NGS應用於臨床診斷無疑將加速先天性巨結腸走向分子診斷的進程。 近期 LuzónToro等藉助RET等26個HSCR易感基因構成的panel，對11位HSCR患者進行NGS靶向測序，其中13個編碼區突變位點及11個調控區突變位點均被證 實HSCR相關，LuzónToro等認為該NGSpanel可作為一種快速、有效的方法來鑒別HSCR患者遺傳背景。另外，一項基於全外顯子測序(whole genoｍe sequencing，ＷES)的研究進一步發現在先天性巨結腸家系樣本中存在高度遺傳異質性。 當前基因座位異質性及等位基因異質性已不再是精準醫學研究的障礙，而真正的挑戰來自於海量數據中的序列變異檢測和數據解讀。 缺乏序列變異檢測和數據解讀的標準化方法已經成為精準醫學的主要難題。 此外，以往單基因研究中確定的表型／基因型相關性以及一個基因／一種表型的傳統觀點，也在被不斷出現的研究成果所挑戰，儘管環境因子及相關暴露因子可能在其中發揮一定作用，然而問題的關鍵可能在於修飾基因對臨床表型的影響。例如L1caｍ作為Et3及Ednrb的修飾基因可影響HSCR中腸神經節細胞缺乏的嚴重性。 更為複雜的是，同一基因的不同 遺 傳 突 變 還 可 能 導 致 多 種 臨 床 表 型，如PHOX2B基因遺傳變異與先天性巨結腸及先天性中樞性肺換氣不足綜合征均存在相關性。

NGS檢測自出現以來就不斷刷新著我們對於基因突變導致臨床表型多樣性的認知，這也預示著將精準引入複雜疾病分子診斷註定是一個漫長的過程。從真正意義上發揮精準醫學的作用，我們需要進一步深入挖掘基因之間複雜的相互作用關係及其遺傳突變位點，以便在個體具有臨床表型之前，精準預測相關疾病的發病、嚴重程度及遺傳表型等，而實現這一目標，我們需要的不僅僅是選擇性檢測某些致病基因，還需要系統地分析更加廣泛且完整的大樣本量遺傳數據。 相信基因組學、分子診斷及臨床診斷的相互結合將會使先天性巨結腸的臨床防治變得更精準。

三、 從系統理論到精準醫學

第二代測序技術的發展使得我們在針對某些疾病的檢測及治療中應首先考慮個體遺傳背景的差異(例如孟德爾遺傳病)，而對於多因素複雜疾病(包括先天性巨結腸、糖尿病及癌症等) 而言，則需要藉助基於系統生物學的方法來制定更為有效的臨床干預方案。 藉助精準醫學深入分析先天性巨結腸等複雜疾病的病理生理機制，首先要明確複雜疾病的多因素本質，其中涵蓋遺傳、表觀遺傳及環境等因素。 對於複雜疾病而言，引入基於系統水平的研究方法是必要的，這也是系統生物學模式的優勢，旨在從基因組、表觀基因組、蛋白質組、代謝組、轉錄組、ｍicroRNA 組、微生物組、互作組及細胞信號網路相關環境因子等水平解析基因型— 表型相互關係及其相應的分子機制。

系統生物學試圖解決兩個關鍵性問題：①什麼使得複雜的系統及網路得以維持？②系統及網路狀態的變化如何導致複雜疾病的發生？ 深入分析功能正常及失調狀態下的系統及網路有助於進一步揭示精準醫學模式下的特徵性分子標記物及臨床干預候選靶點。 另一方面，基於系統生物學的方法本身(包括第二代分子、高通量組學方法以及計算生物學方法)也在不斷推陳出新。 綜合性的系統生物學實驗最初在酵母上完成，包括分析轉錄組、蛋白組、代謝組及其相互作用模式，同時該「真核細胞模型」中採用的絕大多數實驗方法均被編撰成標準實驗方案和數據。這種基於系統水平的研究模式由酵母逐步推廣至其他有機體，並最終應用於人類。 近期 Chen等利用一體化個體組學譜(iPOP，integrative personal oｍics profile，包括個體的基因組學譜、轉錄組學譜、蛋白組學譜、代謝組學譜及自身抗體譜)對單個個體進行了為期14個月的縱向研究，結 果顯示縱向iPOP可通過分析生物標記物及信號通過的動態變化來監測個體的健康狀態，這也進一步說明了系統生物學方法在精準醫學中的關鍵性作用。

另一方面，大數據時代的精準醫學領域中，預測研究讓病例選擇更科學，更符合倫理學原則。基於系統生物學方法的縱向研究(longitudinal investigations)可以幫助我們更全面分析先天性巨結腸等多基因複雜疾病的分子病理生理特徵。 因此，針對特定個體的個性化臨床干預方案還需考慮某一特定時間點系統水平的變化情況，也就是說，對於特定患者的有效治療方案應隨時間改變進行必要的調整。精準醫學本質上屬於生物標記物導向醫學。根據美國食品藥品監督管理局( FDA)及國立衛生研究院(NIH)的標準，生物標記物包括以下幾個類別：①易感／風險生物標記物；②監測生物標記物；③診斷生物標記物；④預測生物標記物；⑤預後生物標記物；⑥藥效／應答生物標記物；⑦安全性生物標記物。 而基於「組學」的系統生物學方法可憑藉「精準」篩選與患病個體分子病理生理機制相關的生物標記物而進一步改善個性化臨床防治策略。

以HSCR為例，通過系統生物學方法篩選生物標記物的過程大致包括以下幾個階段：①以連鎖分析、全基因組關聯分析等遺傳分析策略確定HSCR相關基因組區域(如10q11，9q31等)及潛在易感基因座位；②分析HSCR易感基因相關的蛋白互作網路，以及受轉錄因子調控的特定基因，並結合表達譜研究尋找潛在的生物標記物；近期一項基於血ｍicroRNA表達譜的研究結果顯示，其中由5個ｍiRNA構成的生物標記物可能在HSCR的早期診斷中具有潛在的應用價值；③以生物信息學方法分析相關「組學」數據，發現潛在的互作模式及受影響的信號通路； ④以功能實驗結合動物模型對潛在的生物學標記物進行驗證。 綜上所述，基於精準醫學的臨床干預策略若想在先天性巨結腸等複雜多因素疾病中取得成效，引入系統水平的研究方法是非常必要的，另一方面，以系統生物學模式挖掘先天性巨結腸相關的生物標記物，也必將極大促進精準醫學在先天性巨結腸臨床防治中的應用。

四、 小結

應用系統生物學方法所帶來的海量數據將有助於深度解析HSCR等複雜疾病的分子機制，同時還將促進形成安全有效的生物標記物導向的個性化治療方案。 此外，藉助系統生物學方法，確定HSCR主要遺傳誘因可以避免不必要的診斷性檢查，相應地也可以節約患者的醫療費用支出。 在精準醫學的背景下，面對眾多的臨床治療試驗，人們對於HSCR分子診斷及個性化臨床干預方案的需求無疑會變得更加強。

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