LncRNA PINCR如何調控p53靶標基因的表達

GIF/2K

Prosurvivallongnoncoding RNAPINCRregulates a subset of p53 targets inhuman colorectal cancer cells by bindingto Matrin 3

文獻影響因子：7.

一、調控通路

在細胞DNA損傷的情況下，P53促進LncRNA PINCR表達，然後PINCT招募Matrin-3與P53結合形成複合體結合到P53靶標基因的增強子區域，促進基因的表達使細胞抗死亡能力增強。

二、實驗流程

作者首先通過藥理抑制P53與Matrin-3活性後的基因晶元篩選P53靶標基因和LncRNA，用Matrin-3處理細胞後進行q-pcr檢測幾種RNA的表達篩選出本文主角PINCR。用DOXO（阿黴素：DNA損傷處理）處理P53野生型和P53刪除細胞後檢測PINCR的表達說明DNA損傷後PINCR受P53誘導表達；為了驗證P53對PINCR的作用，作者分別進行熒光素酶實驗和ChIP實驗說明P53促進PINCR啟動子活性。在研究PINCR的功能是，作者首先進行核質分離後檢測PINCR，表明PINCR在細胞核中可能參與基因轉錄過程的調控，然後再進行RNA pull-down、ChIP、co-IP等分別說明PINCR與P53/Matrin-3結合、P53與Matrin-3結合、P53/Matrin-3與靶標基因的啟動子和增強子結合。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是PINCR是在細胞DNA損傷後由P53直接調控的核內LncRNA。

A、q-pcr檢測經Nutlin-3誘導後的結直腸癌癌三種細胞系的P53靶標基因表達，表明PINCR表達升高；

B、q-pcr檢測經DOXO（阿黴素：DNA損傷處理）處理後的P53野生型和突變型細胞的PINCR表達，表明DNA損傷後PINCR表達升高，而P53突變後的PINCR表達明顯比野生型低，說明PINCR表達與P53有關。

C、ChIP-SEQ，分別用Nutlin、5-FU、RITA和CTL處理細胞後用P53抗體獲取與P53結合的DNA片段，產物進行高通量測序，表明Nutlin-3可使P53結合到PINCR啟動子上。

D、ChIP-qpcr，細胞經DOXO（阿黴素：DNA損傷處理）處理後用P53抗體獲取與P53結合的DNA片段，然後進行Q-PCR檢測，表明細胞DNA損傷後P53結合到PINCR啟動子上升。

E-F、熒光素酶實驗，將PINCR啟動子序列連接到熒光素酶報告質粒上，與P53表達質粒共轉染細胞，然後檢測熒光素酶活性，表明P53促進PINCR啟動子活性。

H、核質分離後分別檢測細胞核和細胞質的RNA含量，表明PINCR基本在細胞核中，說明PINCR可能參與的是核內基因的轉錄調控。

Figure2說明的是在DNA損傷時PINCR減少使G1捕獲降低即增加細胞死亡。

A、用CRISPR/Cas9在HCT116細胞中刪除基因組上的PINCR基因，然後用Q-PCR檢測DOXO處理後的細胞PINCR的表達，表明DOXO處理細胞後PINCR升高，而刪除基因後PINCR不能表達。

B-C、採用PI染色做流式細胞術檢測細胞凋亡，DOXO處理細胞後刪除基因組上的PINCR基因的細胞系細胞凋亡明顯比PINCR野生型的多。

D、在刪除基因組上的PINCR基因的細胞中轉染PINCR表達質粒後檢測PINCR表達，表明PINCR在細胞中表達。

E、在刪除基因組上的PINCR基因的細胞中轉染PINCR表達質粒後檢測細胞凋亡，表明PINCR表達使細胞凋亡減少。

F、FISH檢測核孔蛋白和細胞凋亡蛋白，表明DNA損傷後，基因組上刪除了PINCR的細胞細胞凋亡蛋白表達增加。

G、克隆形成觀察，DOXO處理細胞後，細胞的生長減少，基因組上刪除了PINCR的細胞明顯比野生型細胞生長少。

Figure3說明的是DNA損傷後，PINCR調控P53靶標基因的表達。

A、DNA損傷處理後用P53處理的細胞檢測靶標基因表達上升的示意圖，包含PINCR依賴和非依賴基因。

B、用5-氟尿嘧啶處理PINCR野生型和刪除細胞後檢測細胞PINCR依賴的P53靶標基因mRNA的表達，表明5-氟尿嘧啶處理後mRNA表達增加，而PINCR刪除的細胞mRNA表達升高的比野生型的低。

C、用5-氟尿嘧啶處理PINCR野生型和刪除細胞後，用P53抗體獲取細胞中與蛋白結合的DNA片段，然後進行q-pcr檢測，表明表明5-氟尿嘧啶處理後P53結合到其靶標基因啟動子上增加，而PINCR刪除的細胞結合的比野生型的低。

D、用5-氟尿嘧啶處理PINCR敲低細胞後進行q-pcr檢測PINCR和P53靶標基因的表達，表明PINCR敲低後基因表達降低。

E-F、PI染色的流式細胞術檢測細胞凋亡，表明PINCR敲低後細胞凋亡增加。

Figure4說明的是Matrin-3與PINCR結合作為PINCR下游效應因子。

A、RNA pull-down，用生物素標記的PINCR探針獲取細胞中與之結合的蛋白，然後進行多肽光譜分析，表明DOXO處理細胞後，PINCR與Matrin-3結合增加。

B-C、RNApull-down，用生物素標記的PINCR探針獲取DOXO處理後細胞中與之結合的蛋白，然後進行WB檢測，表明PINCR與Matrin-3結合。

D、RIP，用Matrin-3抗體獲取5-氟尿嘧啶處理的細胞中與蛋白結合的RNA，然後進行q-pcr檢測，表明PINCR與Matrin-3結合。

A、將Matrin-3敲低質粒轉染PINCR-WT細胞中，然後進行WB檢測Matrin-3的表達。

B、5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低質粒轉染的PINCR-WT和PINCR刪除細胞，然後進行PI流式細胞術檢測細胞凋亡，表明Matrin-3敲低後細胞凋亡增加。

C、5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低質粒轉染的PINCR-WT和PINCR刪除細胞，然後q-pcr檢測P53靶標基因的表達，表明Matrin-3敲低後靶標基因表達降低。

Figure5說明的是Matrin-3與P53形成複合體結合到PINCR靶標基因的增強子區域。

A、co-IP，用Matrin-3抗體獲取與之結合的蛋白，然後進行WB檢測，表明P53與Matrin-3結合

B、co-IP，用5-氟尿嘧啶處理細胞後細胞提取物分別用Rnase A和Dnase處理然後用Matrin-3抗體獲取與蛋白結合的蛋白，表明P53與Matrin-3是直接結合的。

C、用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞後用Matrin-3抗體獲取與蛋白結合的DNA片段然後進行q-pcr檢測，表明5-氟尿嘧啶處理處理後Matrin-3與P53靶標基因啟動子結合上升。

D、用5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低細胞然後用P53抗體獲取與P53結合的DNA片段進行q-pcr檢測，表明Matrin-3敲低不影響P53與靶標基因啟動子結合。

E、ChIP，用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞後用Matrin-3抗體獲取與蛋白結合的DNA片段，然後用q-pcr檢測P53靶標基因的增強子區，表明5-氟尿嘧啶處理後Matrin-3與P53靶標基因增強子結合增加。

F、用5-氟尿嘧啶處理PINCR-WT和PINCR刪除細胞後用Matrin-3抗體獲取與蛋白結合的DNA片段然後進行q-pcr檢測，表明5-氟尿嘧啶處理處理後P53與靶標基因增強子結合上升。

G、用5-氟尿嘧啶處理Matrin-3敲低細胞然後用P53抗體獲取與P53結合的DNA片段進行q-pcr檢測，表明表明5-氟尿嘧啶處理後P53與靶標基因增強子結合增加，而Matrin-3敲低細胞P53與靶標基因增強子結合不增加。

本公司可提供技術服務

本公司可進行以上類似實驗的實驗設計及整體實驗外包項目，包括q-pcr、Luciferase assay、FISH、RNA pull-down、co-IP、ChIP、WB、慢病毒穩轉株的建立（過表達/敲低），其中核質分離分離、FISH、RNA pull-down、co-IP、ChIP為本公司主營項目。

一、Luciferase assay：熒光素酶實驗檢測轉錄因子與基因啟動子之間的關係。

將PINCR啟動子序列連接到熒光素酶報告質粒上，與P53表達質粒共轉染細胞，然後檢測熒光素酶活性，表明P53促進PINCR啟動子活性。

二、FISH：免疫熒光原位雜交技術，對細胞中的蛋白、RNA、DNA進行定位和定量。

分別用DOXO和CTL處理PINCR野生型和PINCR刪除的細胞，然後FISH檢測核孔蛋白和細胞凋亡蛋白的表達，表明DNA損傷後，基因組上刪除了PINCR的細胞中細胞凋亡蛋白的表達增加。

三、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。

用生物素標記的PINCR探針獲取DOXO處理後細胞中與之結合的蛋白，然後進行WB檢測，表明PINCR與Matrin-3結合。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、ChIP：主要研究蛋白與基因之間的關係。

用5-氟尿嘧啶處理PINCR野生型和PINCR刪除的細胞後，分別用Matrin-3和P53抗體獲取與相應蛋白結合的DNA片段，然後用q-pcr檢測P53靶標基因的增強子，表明5-氟尿嘧啶處理後P53和Matrin-3結合到增強子區域增多，而PINCR刪除的細胞結合比野生型細胞少。說明P53和Matrin-3結合到基因增強子受PINCR調控。我公司在實驗體系中設置陽性及陰性對照，進一步排除系統誤差。

五、CO-IP：研究蛋白與蛋白互作的重要手段。

用5-氟尿嘧啶處理細胞後的細胞提取物分別用Rnase A和Dnase處理，然後用Matrin-3抗體獲取與蛋白結合的蛋白進行WB檢測，表明P53與Matrin-3直接結合的。

參考文獻：RituChaudhary,Berkley Gryder,Wendy S Woods,et al. Prosurvival long noncoding RNAPINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells bybinding to Matrin 3[J]. eLife,2017,6:e23244

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！