選擇性清除分析在牛的遺傳進化分析中的應用

「拖犁負重老黃牛，野草充饑無所求。何懼四時勞苦累，唯祈五穀慶豐收。」

在中國，牛的精神總是為人津津樂道，它以血肉之軀無私奉獻，實現了全心全意為人民服務的偉大精神境界，深深融入到中華文化之中。牛的精神早已植根於中國的傳統文化中，因此小編整理了一篇最近發表的與牛的遺傳進化相關的文章（The genome landscape of indigenous African cattle，Kim et al. Genome Biology 2017），具體闡述了選擇性清除分析在牛的遺傳進化分析中的應用。

摘自廈門牛庄文創園

The genome landscape of indigenous African cattle

基因組水平上對非洲土著牛的研究

研究背景

牛是非洲經濟發展和社會活動的重心，不僅可以作為食物，還可以作為勞動力，並在其他社會活動中具有重要的作用，在非洲社會牛是權利與地位的象徵。現今非洲大陸分布有150種牛，主要有3種：黃牛，瘤牛和二者的雜交種（著名的非洲桑格牛）。非洲生存環境惡劣，而非洲牛卻對非洲炎熱，乾旱，潮濕和多病害的環境具有很強的適應性，因此本文作者針對在遺傳進化中形成的不同品種的非洲牛對非洲惡劣的環境適應機制開展了相關研究。

研究方法

本研究作者選擇了地理來源不同的48頭非洲牛African cattle（圖1：包括10 Ankole桑格牛; 10 Boran波蘭牛; 9 Kenana凱納納牛; 10 N』Dama和9 Ogaden cattle加登牛），利用Illumina HiSeq2000測序平台進行雙端測序，並與此前公布數據的地理來源不同的53個商業品種牛commercial breed（10 Angus安格斯牛；10 Jersey澤西牛；10 Holstein荷蘭牛和23 Hanwoo韓牛）進行聯合分析（以UMD 3.1為參考基因組進行比對分析）。首先分別進行了單核苷酸多態性分析，群體遺傳進化分析（PCA；群體結構；系統發育樹）和種群歷史動態與遷移分析；進而通過群體選擇分析方法-選擇性清除分析（XP-CLR和XP-EHH），針對不同種群間的特異性狀，進行不同品種種群間的比較分析，主要比較包括：（1）N』Dama牛與其它4種非洲牛的比較分析；（2）Ankole與其它4種非洲牛的比較分析；（3）5種非洲牛與4種商業品種的比較分析；（4）非洲瘤牛（Boran ; Kenana ; Ogaden cattle）與4種商業品種的比較分析，分別篩選出了：與N』Dama牛抗錐體蟲機制相關的候選基因；與Ankole牛進化中形成巨型白色的犄角和紅色毛皮相關的候選基因；與非洲牛抗牛蜱蟲機制相關的候選基因和與非洲瘤牛耐熱性相關的候選基因與蛋白，並對相應的候選基因功能進行注釋與研究。

圖1 非洲牛的地理分布

研究結果

1.單核苷酸多態性分析

研究利用Hiseq 2000測序平台，完成了48頭非洲土著牛的測序（測序深度10X），並與此前公布數據的地理來源不同的53個商業品種牛commercial breed進行聯合分析，用Bowtie 2 將測序數據與參考基因組（版本：UMD 3.1）進行比對（比對效率：98.84%；覆蓋度：98.56%），GATK 3.1進行單核苷酸多態性分析，進行低質量SNPs數據過濾處理後，共計獲得約3,700,000 SNPs，進而利用SnpSift進行9個種群（Boran; Ogaden cattle; Kenana; Ankole; N』Dama; Angus; Jersey; Holstein; Hanwoo）特異的SNPs分析。通過9個群體間核苷酸多態性的比對發現，非洲瘤牛（Boran, Kenana, Ogaden）與商業品種牛（Angus；Jersey；Holstein和Hanwo）相比，具有較高的單核苷酸多態性；N』Dama 的多態性相對較低（圖2和圖3）。

圖2 核苷酸多態性分析

圖3 核苷酸多態性在基因組上的分布

2.群體遺傳進化分析

分別利用EIGENSTRAT，STRUCTURE進行PCA分析與群體結構分析：PCA分析中，非洲牛與商業品種牛群體完全分開，桑格牛居中，並無離群物種（圖4）。在群體結構分析中，K為假定的祖先群數量（K=1~9），分析結果顯示：當K=2時，樣品具有最佳分群，黃牛與瘤牛之間發生分歧；當K=3時，桑格牛與N』Dama，亞洲瘤牛，商業牛具有相同的遺傳背景（圖5）。進而利用距離法構建系統發育樹，Boran; Ogaden cattle; Kenana; Ankole; N』Dama; Angus; Jersey; Holstein; Hanwoo共計9個種群的系統發育樹結果顯示（圖6）：歐洲商業品種牛聚類到一起，Hanwoo與N』Dama親緣關係較近；非洲瘤牛聚類到一起，桑格牛位於瘤牛與N』Dama之間，同時9個種群體呈現9個單系群，無離群物種。

圖4 PCA分析

圖5 群體結構分析

圖6 系統發育樹（neighbor-joining tree）

3.種群歷史動態與遷移分析

有效群體大小的變化（圖7）結果顯示：N』Dama 牛與其它非洲牛相比，經歷了強烈的種群數量的衰減，這與種群的瓶頸效應有關。此外，距今1000年前，Ogaden 和 Kenana 種群大小有略微的增漲，而這與隨著非洲大陸的號角中的第一波瘤牛的入駐有關。同時發現：大約公元前10,000年，所有種群經歷了種群數量衰減，可能與當時發生的新石器時代馴化事件相關。進而，利用Treemix進行基因流分析，結果顯示：歐洲黃牛與桑格牛之間發生了基因交流（圖8）。

圖7 五種非洲牛的有效群體大小的估算（與商業牛比較）

圖8 基因流分析

4.選擇性清除分析

利用選擇性清除分析方法（XP-CLR和XP-EHH），針對不同種群間的特異性狀，進行不同品種種群間的比較分析，進而對馴化過程中的差異基因進行功能注釋。

（1）N』Dama牛與其它4種非洲牛的比較分析

N』Dama牛與其它4種非洲牛相比，具有抗錐體蟲的特點，其抗錐體蟲的機制主要有2點：a. 抗貧血 b. 控制寄生蟲擴散。

通過N』Dama牛具（抗錐體蟲）與非洲瘤牛（Boran ; Kenana ; Ogaden cattle，感錐體蟲）群體間的選擇性清除分析，篩選出了5個基因（SLC40A1, STOM, SBDS, EPB42和 RPS26）與貧血相關，其中基因SLC40A1受到了強選擇。進而篩選了這些候選基因的非同義突變位點，結果發現N』Dama牛中STOM (p.Met48Val) 和 EPB42 (p.Arg503His)蛋白因SNP的錯義而發生了氨基酸的改變（圖9），與其它4種非洲牛相比，N』Dama牛中同時發生了這兩種等位基因的變異。

圖9 基因EPB42 (p.Arg503His) 和基因STOM (p.Met48Val) 外顯子區發生的非同義突變

轉錄因子kappaB (NF-kB)是對微生物病原體的先天和後天免疫反應的中心，可以調節細胞對感染的反應。通過選擇性清除分析中篩選了與NF-kB相關受到正選擇基因，這些基因有效的調控了錐體蟲的感染。

（2）Ankole與其它4種非洲牛的比較分析

Ankole牛與其它非洲牛比較的顯著特點為：Ankole牛有巨大的白色犄角和紅色的毛皮。通過選擇性清除分析首選篩選出了與毛皮顏色相關的功能基因：基因MC1R和基因KIT；基因的過表達分析顯示：FGF信號通路（成纖維細胞生長因子信號通路）與骨骼發育過程中成骨細胞的分化有關，與FGF信號通路相關的基因（MAP3K5, PPP2R2C, FGF18, 和FRS3, P00021）可能是控制Ankole牛與其它非洲牛相比表現獨特形態（生長巨大的犄角）的基因，並且這些基因在其它非洲牛中均未受到正向選擇作用。

（3）5種非洲牛與4種商業品種的比較分析

非洲牛在進化過程中可以適應嚴厲的環境條件，如熱帶疾病，高溫，乾旱和營養貧瘠的環境。通過非洲牛與商業品種牛群體間的選擇性清除分析發現蛋白BOLA-DRB3與抗牛蜱蟲機制相關，進一步闡明非洲牛中的BOLA基因在對其具有先天免疫來抵抗熱帶寄生蟲病（如東海岸熱）具有重要作用。

（4）非洲瘤牛（Boran ; Kenana ; Ogaden cattle）與4種商業品種的比較分析

有研究表明非洲牛具有更好的溫度調節機制，同時非洲瘤牛對高溫脅迫具有更好的調節能力，進而本研究作者選擇了非洲瘤牛與商業品種進行比較，進行選擇性清除分析，發現基因SOD1在非洲瘤牛與商業品種在對高溫脅迫中表現出差異。基因的功能注釋結果顯示：基因SOD1的3』外顯子區因SNP的錯義而引發了氨基酸的非同義突變（圖10 p.Ile95Phe），而這種突變在非洲瘤牛中高達95%，進一步證明了基因SOD1在非洲牛對高溫脅迫機制中具有重要作用。

圖10 基因SOD1在3』外顯子區發生的非同義突變（p.Ile95Phe）

另有研究表明在對溫度的調控中，非洲牛，尤其是非洲瘤牛的催乳激素基因PRLH和其受體基因PRLR具有正向選擇優勢。

總結

本研究通過對非洲大陸具有代表性的品種牛在基因組層面的比較分析，利用遺傳進化相關分析方法，深入的探究的了非洲牛對氣候（高溫脅迫），疾病（錐蟲病）和人工選擇（毛皮顏色和犄角的發育）的相關機制，對研究非洲大陸牛種群遺傳多樣性具有重要意義。

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