3D列印幹細胞技術用於組織器官重建的現狀與思考

李金泰 藍升 劉毅

摘要

幹細胞具有很強的自我更新和多向分化能力，在組織工程領域具有獨特的優勢。近幾年來，3D列印技術在生物醫學領域的應用獲得快速發展，特別在人體器官列印方面的應用研究成為社會關注的焦點，具有良好的發展前景和巨大的社會價值。本文主要從幹細胞的種類和來源、3D列印器官的定義、幹細胞聯合3D列印進行器官重建的現狀和目前存在的問題等方面，闡述兩項技術的結合可能產生1+1＞2的效應，為組織器官重建的研究和臨床應用提供新思路。

【關鍵詞】幹細胞；3D列印；組織器官重建；生物系統；器官移植

組織器官移植是目前治療終末期器官功能障礙唯一有效的方法，但供體器官缺乏、組織相容性問題等原因嚴重限制組織器官移植的發展。隨著醫學技術的不斷發展，人們正試圖從機械器官替代、異種器官移植、組織工程和再生醫學等方面來打破組織器官移植的瓶頸，其中3D列印（3D printing）與幹細胞移植相結合的技術可能代表了未來研究的突破方向。

從材料學的角度看，人體是由布局精密、功能複雜且互相緊密聯繫的生物材料構成的。建房子時，建築工程師首先繪製精確的圖紙，然後再購買沙子、水泥、鋼筋，最後由建築工人運用相關的機器按照圖紙建造房子。事實上構建人體的組織器官類似於建房子，只不過其過程要遠比前者複雜精密。各種幹細胞可以提供「沙子」、「水泥」、「鋼筋」，而3D列印技術就是需要「圖紙」、靈活的「機器」和「建築工人」。

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幹細胞的種類和來源

正常組織具有自我更新和修復能力，參與修復更新的主要成分是各種組織特異性幹細胞，例如造血幹細胞、表皮幹細胞、腸腺幹細胞。在一些更替緩慢的組織如神經組織、心臟組織中，也發現了組織特異性幹細胞的存在。幹細胞具有很強的自我更新及定向分化能力，在細胞來源、增殖、定向分化及重建器官的植入等方面均具有較明顯的優勢。根據幹細胞來源可分為胚胎幹細胞和組織特異性幹細胞。胚胎幹細胞是在胚胎髮育早期——囊胚（受精後約5～7 d）細胞團中的細胞，能大量繁殖並保持未分化狀態，也可分化成3個胚層中的任意一種細胞[1-2]。組織特異性幹細胞是從外周組織分離、培養、擴增而來的。除了以上兩類幹細胞，還有一類誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cell，iPS），近些年的研究表明iPS的生物學特性、增殖特點及分化潛能類似胚胎幹細胞，可以由單個細胞分化為內胚層、中胚層和外胚層所有的細胞，進而形成身體的所有組織和器官[3]。iPS獲取相對方便，2012年Margariti等[4]在重編程人皮膚細胞時將iPS的獲取時間縮短為4 d。

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3D列印的概念

3D列印技術，在技術界也稱為「增材製造」、「自由成形」、「快速成形」或「分層製造」等，是一種快速成型技術，由計算機輔助設計（computer aided design，CAD）數據通過成型設備以材料逐層堆積的方式實現實體成型。3D列印技術應用在醫學上採用CT、正電子發射斷層顯像-X線計算機體層成像（positron emission tomography-computed tomography，PET-CT）、MRI或3D相機等影像手段獲得需要列印的器官三維數字信息，使用CAD程序建模，然後3D印表機根據建好的數字模型逐層列印出實物模型。近幾年，3D列印技術在生物醫學領域的應用獲得快速發展，特別在人體器官列印方面的應用研究成為社會關注的焦點，具有良好的發展前景和巨大的社會價值。

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幹細胞聯合3D列印用於器官重建的現狀

器官重建在實驗室取得了不小的成績，其通用的做法是首先提供一個生物支架，然後圍繞支架進行細胞的培養、聚集，最終形成器官。支架的來源包括兩種：一種是3D列印的支架，比如把水凝膠等可降解材料列印成細胞支架，可以建立適合活性細胞存活的精確三維結構，有研究者將聚乙烯醇水凝膠用於細胞培養，並對細胞的力學響應行為進行了初步研究[5]；另一種是將脫細胞處理的器官作為支架，有研究利用大鼠脫細胞肝三維支架為小鼠間充質幹細胞提供體外培養和誘導分化微環境，能夠高效地誘導間充質幹細胞向類肝細胞分化、表達更加穩定和豐富的肝細胞功能，並在移植體內後對慢性肝損傷表現出較好的治療作用[6]。

通過3D列印進行器官重建取得了如下成果，包括簡單器官列印，如耳廓，也包括複雜器官列印，如心臟、肝臟。美國康奈爾大學生物工程學家與威爾康乃爾醫學院的醫師組成的研究團隊利用活細胞製成的可注射膠技術，結合3D列印技術造出了與人耳幾乎完全一樣的器官耳。在3個月時間內，這些器官耳長出軟骨，替換掉其中用於定型的膠原[7]。法國蓬皮杜歐洲醫院使用生物活性組織與電子元件相結合的方式，製造出一個人造心臟，並完成世界上首例人工心臟移植手術。美國Organovo公司利用手術切除的部分肝臟列印的微型肝臟已具備了真正肝臟的大部分功能。在這一微型肝臟中有來自血管內壁的細胞。這些細胞形成一張精妙的管道網向肝細胞供應營養和氧氣，使細胞和組織得以存活5 d以上[8]。目前已有可吸收冠狀動脈支架應用於人體的報道[9-10]，外周血管可吸收支架在歐盟和美國已均在臨床試驗中，國內有學者提出生物3D列印結合靜電紡絲製備複合生物可吸收血管支架的新方法[11]，需進一步驗證。

當前關於幹細胞聯合3D列印用於器官重建的報道相對較少。蘇格蘭研究人員利用3D列印技術，首次嘗試用人類胚胎幹細胞進行3D列印[12]。研究人員利用氣閥列印技術，通過改變開關氣閥的噴嘴直徑、進口氣壓和閥門打開時間來達到精確地控制細胞放置數量，這種氣動列印技術非常柔和，足以保持幹細胞的高存活率，也能夠精確地製造出統一尺寸的細胞團。對列印出來的細胞團檢測結果顯示，列印24 h後，95%以上細胞仍然存活，列印過程未殺死細胞；3 d後，超過89%細胞存活。檢測顯示列印出的胚胎幹細胞保持了它們的多能性，具備像正常的人類胚胎幹細胞一樣分化潛能。由胚胎幹細胞列印出的三維結構有望創造出更準確的人體組織模型，這是一次真正意義上的幹細胞結合3D列印技術的實踐。

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幹細胞聯合3D列印用於器官重建存在的挑戰

4.1

幹細胞來源

目前幹細胞無法通過形態進行識別，只能通過免疫表型或者細胞的功能進行判斷。同時體內的幹細胞數量有限且分布分散，因此想從體內尋找大量幹細胞並不容易，而胚胎幹細胞的獲得面臨較大的倫理學障礙。目前人們已在探索將幹細胞進行體外克隆以獲得足夠多的數量。任衛青等[13]將3代以內的小鼠胎兒成纖維細胞（mouse embryo fibroblast，MEF）按不同密度接種培養，顯示發育至囊胚的胚胎其小鼠胎兒成纖維細胞密度為1×105/mL，同時培養液中添加幹細胞生長因子和胰島素時更適合昆明小鼠胚胎幹細胞的分離培養，所分離的細胞鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）染色強陽性，Oct-4、SSEA-1免疫熒光檢測陽性，具有胚胎幹細胞的特點，提示該方法便於小鼠胚胎幹細胞的大量分離和培養。但是該方法能否用於人類幹細胞分離培養尚未可知。

4.2

列印工藝尚需改進

這個問題涉及範圍比較廣，至少涉及幹細胞的排布、細胞團中血管的列印、列印器官的存活時間及有無生理功能等。例如，人體腎臟的微觀結構十分複雜，即便是腎單位這一由不同細胞構成的結構也都極其精妙，而其營養、支撐結構能有機結合在一起就更加複雜了。當前的技術水平還達不到這樣精妙微觀結構的列印。此外，腎臟的細胞與細胞之間存在複雜的相互作用，同時腎臟與腎外器官具有密切聯繫，腎臟本身也受到神經內分泌的調控，3D列印的腎臟很難具有這些功能。

4.3

組織相容性問題

3D列印進行器官重建的目的是為了將其應用於人體病變器官的替換。大家都知道凡是外來的組織或者異物移植於人體，正常人都會產生免疫排斥，受者因此不得不長期依賴免疫抑製劑以阻斷這種排斥反應。雖然有理由相信將來來源於患者本身幹細胞重建的器官有望降低排斥反應，但這一目標的實現仍然需要研究人員長期的探索。

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對幹細胞聯合3D列印進行器官重建的展望

不妨我們換位思考，作為1例尿毒症患者需要移植什麼樣的腎臟？歸納起來大致可以分兩種：一種是其同時具有腎臟的形態結構和生理功能；另一種是其只具有生理功能，而並不具有腎臟的形態、結構。可想而知前者必定製作困難、成本高昂，而後者製作則相對簡單，成本相對低廉。目前科研人員在3D列印進行器官重建時或多或少「思維定式」般地認為所製作的器官必須是前者，然而是不是只有重建出如前者那樣的器官才算成功？筆者認為科研人員應當看到在當前及今後相當長的一段時間內由於技術和裝備所限，我們難以製作出如前者的器官，或許只能退而求其次，也就是把追求先製作出只具有生理功能的器官也視作一種成功。

科研人員應當跳出如前所述的這個「思維定式」，事實上在某些不影響美觀的部位比如腹腔內或者胸腔內，患者首先需要的是移植器官具有相應的功能，並不要求其一定具備相應器官的形狀和結構。那麼科研人員完全可以探索其它既方便製造、成本低廉又能保證列印器官具有相應生理功能的工藝、方法。例如，完全可以列印一個長方體形的或者幾個長方體串聯或者並聯後形成的「腎臟」，可以將人的腎臟進行類似微分或積分的思考——微分下的腎臟可以是腎單位，先製作出腎單位，然後將更多的腎單位進行有機的整合形成腎實質，再分別進行重吸收系統和集合系統的製作，達到相當的數量時可以通過血管將這些結構串聯或者並連起來，形成一個具有上游和下游的結構，這樣的結構似乎更像是一個具有腎臟生理功能的生物系統。

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總結

綜上所述，幹細胞技術和3D列印技術各自具有獨特的優勢，它們的這些優勢特點在組織器官重建領域的價值被寄予相當高的期望，而嘗試將兩者結合起來，或許更能產生1+1＞2的效應。雖然目前幹細胞的來源、培養、誘導分化等諸多問題尚未解決，且3D列印技術用於器官移植還有眾多瓶頸性技術未能突破，但是筆者認為將幹細胞技術與3D列印技術的結合可以為將來真正實現器官列印提供強有力的支持，進而為器官移植領域的器官短缺問題開闢出新的路徑，為眾多患者帶來福音。

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