OneShinelong-noncodingRNA過表達細胞文庫 積跬步至千里

CRISPR技術，在當今業內可謂是「爆款」，眾多技術達人紛紛投入研究CRISPR技術，然而出成果的極少，難道是CRISPR技術之路如此坎坷，竟是無數英雄折戟？不是的，不是沒有成果，只是被人所忽略，正如「西瓜」、「芝麻」，眼中儘是「西瓜」，怎會去關注「芝麻」呢？然而，CRISPR技術之路確實前景廣闊，但也不是儘是「西瓜」，從小處積累，也是有必要的！

看OneShine CRISPR/Cas9 long noncoding RNA 過表達細胞文庫積跬步：

此系統包括lentiSAMv2質粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro質粒。lentiSAMv2質粒如圖一所示，其中，eSpcas9(1.1)也叫做dCas9，是將Cas9酶切位點突變後形成的，它只具有結合基因組和sgRNA的能力，而不具備切割DNA的能力。lentiSAMv2質粒是經過改造的gRNA質粒，在sgRNA後面加入了19個鹼基（MS2 binding site）。這19個鹼基經過轉錄後形成一個具有莖環結構的RNA，此RNA能特異性地與MS2蛋白結合。而在另一個載體上，MS2蛋白已經與P65、HSF1蛋白融合。其中，P65、HSF1是兩個轉錄因子。因此，當兩個載體同時進入同一個細胞後，lentiSAMv2質粒表達「sgRNA- MS2 binding site「融合RNA及dCas9蛋白，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro載體表達MS2-P65-HSF1。在dCas9作用下，則形成「基因組DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1」這一超級複合體。當sgRNA為轉錄起始位點時，此超級複合體定位於轉錄起始位點，由於P65、HSF1可以募集更多轉錄因子，因此可啟動轉錄，從而激活轉錄起始位點後面的基因表達。

將合成的9萬多個long noncoding RNA轉錄起始位點的sgRNA（對應1萬多個lncRNA），分別載入lentiSAMv2質粒中，再把此9萬多個質粒混合起來，形成文庫。並且將此文庫整合到了細胞中，一個125c㎡細胞培養瓶中含有約10^8個細胞，每個細胞被激活一個lncRNA，共約1萬個lncRNA被激活，所以含有每個特定基因缺陷的細胞約有10000個（10^8/1萬）。

看OneShine CRISPR/Cas9 long noncoding RNA 過表達細胞文庫至千里：

【應用舉例：細胞凋亡相關long noncoding RNA篩選】

取細胞文庫進行擴增，然後平均分成兩份，每一份包含10^8個細胞，每個細胞被激活了一個long noncoding RNA，共約1萬個lncRNA被激活，所以含有每個特定激活lncRNA的細胞約有10000個（10^8/1萬）。向其中一份細胞中加入放線菌素D、誘導細胞凋亡（A組），在另一份細胞中加入溶劑、作為對照（B組）。A組用流式細胞儀篩選出凋亡細胞A1、未凋亡細胞A2。B組用流式細胞儀篩選出凋亡細胞B1、未凋亡細胞B2。分別對A1、A2、B1、B2進行短測序，檢測哪些lncRNA被激活了。A2中被激活的lncRNA即為能抵抗凋亡的lncRNA，B1中被激活的即為能誘導凋亡的lncRNA。其它應用：

（1）新葯靶點確定與驗證

（2）環狀RNA上游調控機制分析、下游調控機理分析

（3）Long noncoding RNA作用機制驗證

（4）脂肪代謝機制研究

（5）幹細胞自我更新、不對稱性分裂機制等。

回顧CRISPR技術發展之路，也是起始於微末，正是不斷積累，造就CRISPR技術在業內現在的地位。CRISPRJ技術之路在何方？其實就在腳下，得靠我們自己一步步去走。而且在CRISPR技術這條寬闊大道上，不乏眾多志同道合之士，我們當共同勉勵，讓CRISPR技術之路更加寬闊！

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