深度報告：蛋白質、漁業生物技術，對水產養殖有何影響！

蛋白質組：現狀，挑戰和展望

報告摘要

宏蛋白質組學是在宏組學或生態組學中一個新興的領域。它用於調查一個複雜生態系統中大規模的蛋白質表達，提供直接的生理和代謝活動證據。

宏蛋白質組學研究將加強我們對於微生物世界的了解，連接微生物群落及其生態功能。近期，從不同的海洋環境中獲得的大量宏基因組序列將後基因組時代擴展到海洋科學領域。儘管宏蛋白質組研究還處於起步期，但是它在各類環境的微生物功能基因表達，生物地球化學功能以及它們與環境的相互作用等方面，已展現出強大的潛力。對於複雜的海洋樣本，宏蛋白質組學技術仍面臨巨大的挑戰。

這篇會議報告總結了當前在海洋宏蛋白質組學領域的最新進展，同時探討了該技術在研究海洋生態系統中所面臨的挑戰和前景。

研究背景

海洋生態系統具有高度的動態性和多樣性，其中微生物佔據90%的海洋生物量。現代分子生物學揭示，自然界中微生物群落及其棲息的環境遠比人們預期要複雜和多樣。目前超過90%微生物尚無法通過實驗室純培養，需要強大的組學技術研究來幫助了解環境中實際的微生物類群（圖一）。

圖一：海洋微生物研究中的關鍵組學方法（Zoetendalet al., 2008）

其中宏蛋白質組學是從蛋白質水平對特定地點和時間的環境微生物群落的所有蛋白質組成進行大規模分析，更深入的研究微生物群落結構多樣性和代謝活性等。

宏蛋白質組學研究策略

在海洋宏蛋白質組學的研究中主要有基於凝膠和非凝膠兩種方法（圖二）。非凝膠質譜法相較於傳統的基於凝膠的方法在蛋白質鑒定方面具有更高通量。目前，非凝膠法在海洋宏蛋白質組學研究方面的應用更廣泛。

圖二: 基於凝膠和非凝膠的蛋白質組學方法（Wanget al.,2015）

海洋宏蛋白質組學研究現狀

01 海水中的微生物群落

重要海洋微生物

SAR11細菌是一種從沿海到海洋都廣泛存在的重要微生物。它主要存在於海水表層的浮游微生物群落中。研究表明，營養的傳遞對於微生物的生存和競爭是非常重要且必要的。雖然磷在沿岸海水中是一個限制性因素，然而氮在微生物競爭中起到重要作用（Sowellet al., 2009&2011; Morriset al., 2002&2010）。

圖三：南大西洋樣品鑒定的蛋白的丰度和分布，MS/MS spectra值按照功能注釋分類進行匯總（Morriset al., 2010）

海洋表層宏蛋白質組

熱帶印度洋表層的宏蛋白質組數據表明，微生物群落的組成差異小於16S rRNA測序得到的微生物群落組成。它們的種類和功能分布均比較均勻，但關鍵微生物類群存在功能亞群，可能是由於環境誘導的微進化導致（Gaiet al., unpublished data）。

海洋病毒群落

海洋病毒組學近年來成為研究熱點。2016年Brum等通過宏蛋白質組學方法結合基因組學研究了海洋病毒宏蛋白質組（Brumet al., 2016）。他們鑒定到1875個海洋病毒相關蛋白，其中近一半的蛋白是新注釋的病毒初級結構蛋白。四個丰度最高的蛋白簇被注釋為新的病毒衣殼蛋白，它們廣泛存在於海洋中（圖四）。

圖四：病毒宏蛋白質組數據幫助注釋過去未知功能的蛋白（J. Brumet al., 2016）

與此同時，Xie等對中國南海海洋病毒濃縮液的宏蛋白質組進行了研究，發現了浮游病毒群落的重要類群及釋放到水體中的重要非病毒蛋白，主要為高丰度的周間質蛋白，如大量轉運蛋白和SBP56蛋白，其中SBP56被預測有去除過氧化物的功能（圖五）。

圖五：鑒定出的非病毒蛋白在各微生物菌群中的含量及功能分類（Xieet al.，2017）

02海洋有機物

海洋有機物是生物圈中最大的有機碳池之一，它能調節海洋碳循環和全球氣候（圖六）。

圖六：海洋中有機物循環（POM: 顆粒有機物；DOM：溶解有機物）

隨著海水深度的增加，細胞代謝，產能和有機質傳遞快速減弱。但是在深海中鑒定到浮游植物蛋白，說明浮遊動物的糞便打包保護，微米膠或者納米膠等保護作用在海洋有機物從上至下傳遞起著重要作用。此外，病毒在海洋碳等營養鹽循環中也起到重要作用。

03浮游植物藻華期間的微生物群落

海洋浮游植物藻華期間產生的底物為微生物提供了一系列的生態位，幫助一些特殊的微生物種群繁衍。

Li等研究發現，細菌群落結構和代謝活性會隨著甲藻藻華的進程而動態變化。蛋白質TBDRs（TonB-dependent receptors）在細菌群落的演替中起著重要作用（圖七）。

圖七：各Transporter蛋白在菌群各菌屬中的表達量

同時Pseudoalteromonadaceae是一種重要的細菌，在甲藻藻華後期與甲藻細胞相互作用，可能起著調節甲藻藻華的進程作用（圖八）。

圖八：甲藻水華髮生各階段中菌群的組成（Liet al., 2017）

總結，儘管海洋宏蛋白質組學仍處於起步階段，但它已經向我們展示了強大的研究潛力，提高我們對原位微生物群落的了解以及它們與環境及宿主的相互作用。

挑戰和前景

挑戰：

1. 樣品製備的複雜性；

2. 高質量的蛋白資料庫的可用性；

3. 蛋白質組學數據的可視化。

前景：

1. 針對單個關鍵菌種或目標物，可以藉助流式細胞分選技術開展宏蛋白質組和宏基因組分析；單細胞蛋白質組和基因組學研究；目標功能蛋白質組（比如transporters）的研究；

2. 針對整個微生物群落可以根據微生物大小將微生物群落分成多組分，同時改進質譜的靈敏度和精度；

3. 應用半定量或熒游標記法對宏蛋白質組進行定量分析；

4. 結合其他組學方法進行系統組學研究。

展望：

提出創建The Proteomic Encyclopedia of Marine Bacteria and Archaea (PEMBA)平台推動海洋微生物生態功能和作用研究

1. 構建培養的或者非培養的微生物的參考蛋白質組圖譜；

2. 構建菌種水平的蛋白質組圖譜；

3. 構建時間和空間水平上蛋白質組圖譜。

水產養殖與漁業生物技術

一、報告摘要

通過基因編輯或者基因工程手段改造物種並驗證其性狀變化已廣泛應用於實驗中，且部分成果已經投入生產。

在水生生物中，尤其是魚類中的這類研究相對植物以及哺乳動物較少，Dunham及其團隊以鯰魚及鯉魚為研究對象，進行了多方向、大跨度的基因編輯和基因工程研究，針對不同的有實踐意義的目標，取得了豐富的成果。

二、 魚類中基因工程研究歷史

自從1981年第一隻基因改造小鼠誕生以來，基因工程在魚類中的應用也隨之成為熱點。 中國科學家朱作言帶領的團隊完成了世界首例基因工程改造魚類的實驗，將人類的生長因子基因成功轉入到金魚的基因組中。隨後，日本和法國科學家也成功利用基因工程技術改造了青鱂和虹鱒魚的基因組。美國首例的基因工程改造魚類——斑點叉尾鮰，在Auburn大學的遺傳研究中心由Dunham負責的團隊改造完成，他們將人類生長因子基因轉入到斑點叉尾鮰中，取得了重大的成功。

與野生型魚類相比，基因改造魚的生長速率提升了40%，有的個體甚至達到十倍。雖然在三文魚中轉入的抗凍蛋白基因並不能有效地提高三文魚在極低溫度下的存活率，但是當該基因改造應用於金魚中時，金魚的抗凍能力大大提高。其他的成功案例包括，在斑馬魚轉入多色熒光蛋白基因並成功創造了商業化斑馬魚品系。在多種魚類中，通過基因改造手段來增強其抗病性也取得了顯著效果。同時基因改造魚也可作為「生物工廠」製造醫用蛋白。

三、Dunham團隊近期的成果

Dunham教授介紹了其團隊近期利用基因工程改造、基因編輯等技術，在鯰魚快速生長、抗病、人工可控絕育、營養及肉質改善等方面取得的進展。

通過基因工程手段過表達斑點叉尾鮰生長因子基因，成功的使改造型斑點叉尾鮰的生長速率相對野生型提高了百分之一百到三百。同時，通過基因編輯手段，利用CRISPR/Cas9系統作為工具，敲除斑點叉尾鮰全部兩個拷貝的Myostatin（一種重要的生長差異因子）基因，大幅提高了被編輯魚類的肌肉乾重和總體重。

利用基因工程改造，轉入了preprocecropin B或者cecropin B基因的鯰魚，在F.columnare和E. ictaluri侵染挑戰實驗中，存活率相比野生型均取得了大幅提高。

利用RNA干擾技術，干擾胚胎髮育時期原生殖細胞的遷移，能夠導致魚類的配子腺不發育。通過基因工程以及基因編輯手段，可以在RNA干擾元件序列之前添加「開關」式的啟動子，該類『開關』受實驗室環境中人工添加化合物的控制，可以是RNA干擾起始或者停止，達到人工控制鯰魚配子腺發育的目的。

鯰魚中脂肪酸表達量相對偏低，人工導入或者原位過表達鯰魚中的Omega3與Omega5脂肪酸，不但成功的提高了鯰魚肉的營養含量，更是改善了其肉質。

四、未來展望

經過25年的FDA審查，由AquaBounty公司開發的基因工程改造魚——Aquadvatage Salmon於2015年成功獲得批准，在北美進入市場。該品系的三文魚生長到市場大小的周期相比野生型縮短了一半以上，同時有著更高的餵食轉化率（FCR），大幅降低了生產、養殖成本。在未來，因其多方面的性狀優勢，高效的育種方式，更多的基因工程、基因編輯魚類品系會給我們的水產、水族市場帶來更多的選擇。

END

來源：青島華大（作者：王大志、Rex A Dunha）

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