分子標記輔助育種技術的發展與應用
採用相同的父母本進行雜交，為什麼有的育種家可以成功育成新品種，有的育種家卻一無所獲呢？
道理很簡單，兩個親本雜交會產生成千上萬種組合情況，如何從中挑選出最好的基因型，取決於育種家的理論知識和正確的育種方案，以及育種家敏銳的眼光以及育種經驗還與外界的環境條件有關。
近十年來，分子標記輔助育種為植物育種提供了一種以DNA變異為基礎的遺傳標記，下面我們來進行簡單的了解。
遺傳標記應具備的條件
1、多態性高
2、表現為共顯性，能鑒別出純合基因型和雜合基因型
3、對主要農藝性狀影響小
4、經濟方便，便於觀察記載
分子標記輔助育種的發展過程
一、分子標記輔助育種--RFLP
限制性片段長度多態性（RFLP）是發展最早的分子標記技術。原理是：植物基因組DNA上鹼基替換、插入、缺失或重複等，造成某些限制性內切酶酶切位點的增加或者喪失，從而產生限制性片段長度多態性。
2008年，萬建民實驗室發表在Cell Research上的一篇文章，通過Asominori與CSSL28構建F2分離群體，圖位克隆分析該QTL位點，利用染色體片段置換系材料精細定位了多環境、多遺傳背景穩定表達並控制粒寬、粒重基因GW5。這篇文獻就使用了RFLP分子標記輔助育種的方法。
Asominori×IR24 RIL群體以Asominori為母本，IR24為父本，配置雜交組合，採用單粒傳法獲得71個F7代株系所組成。以Asominori為遺傳背景的CSSL群體是利用上述RIL群體中的19個株系與Asominori連續回交4次，建立BC3F1。藉助116個RFLP標記，對268個BC3F1植株進行輔助選擇，根據各個染色體的置換位置，選擇不同置換區域的雜合個體自交，得到約400個BC3F2個體，進一步分子標記輔助選擇，獲得66個具有供體IR24染色體片段的純合置換系，CSSL28就是其中之一。
總結RFLP的優缺點：
優點：
可以確定多態性是由父本還是由母本產生的
可以確定多態性的產生是由鹼基突變、倒位、缺失或插入哪種類型造成的。
遍布低拷貝編碼序列，且非常穩定。
缺點：
實驗繁瑣，檢測周期長，成本高，不適於大規模的分子育種。
2、基於PCR技術的分子標記
2.1 RAPD技術
隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）應用了PCR反應的原理，以不同的基因組DNA為模板，以單一的隨機寡聚核苷酸（長度多為10個核苷酸）為引物而獲得的一定擴增產物。由於不同基因組DNA序列存在著差異，其不同區段上可與引物同源互補的位點不同，擴增產物的數量、大小也不同，因而表現出多態性。這些DNA片段鑒定後證明可以作為分子標記的則稱之為RAPD標記。
在1991年，法國的生物學家Michelmore首次將BSA技術應用到萵苣的霉病抗性基因位點的驗證之中，他利用RFLP和RAPD兩種標記對兩個不同抗性的萵苣混合樣本進行探究，根據不同混池樣本的RFLP和RAPD凝膠電泳成像結果，最終找到了3個與霉病抗性基因緊密相關的標記（下圖是RAPD分析結果）。
總結RAPD的優缺點：
優點：
無需專門設計RAPD 擴增反應引物，也無須預先知道核苷酸序
每個RAPD 反應中，僅加單個引物，就可通過引物和模板DNA 隨機配對實現擴增
退火溫度低，一般為36℃
RAPD 技術簡便易行、省時省力
RAPD 分析所需的DNA 樣品量極少
缺點：
影響因素較多，重複性較差
2.2 SSR標記
SSR標記是指簡單重複序列標記，根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由於核心序列串聯重複數目不同，從而表現出不同個體在同一個微衛星座位上微衛星的長度多態性。
2017年11月20日，中國農業科學院在NaturePlants發表了一篇小麥D基因組測序的文章。該研究通過組裝出高質量染色體水平的節節麥基因組，繪製節節麥TE全基因組分布圖譜，分析TE對D基因組進化、基因結構和基因表達的多重影響。該文獻中應用735個RFLP、3,536個SSR標記以及大量SNP標記定位到節節麥基因組上，獲得一個下圖所示的高精度綜合遺傳圖譜。
總結SSR的優缺點：
優點：
數量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態性高
具有多等位基因的特性，提供的信息量高
以孟德爾方式遺傳，呈共顯性
每個位點由設計的引物順序決定，便於不同的實驗
缺點：
費用相當高
2.3 AFLP標記
AFLP指擴增片段長度多態性，該技術是一項新的分子標記技術，是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。
2017年7月21日，中央民族大學民族植物學創新團隊揭示了山茶花絢麗多變的分子基礎，該團隊對5個研究地點收集的190份雲南山茶C. reticulata樣本使用AFLP標記手段獲得種群內和種群間的遺傳多樣性，下圖是根據AFLP數據建立的山茶品種形態特徵的相關性聚類圖。
總結AFLP的優缺點：
優點：
分析所需DNA量少
可重複性好
多態性強
解析度高
有較大穩定的遺傳性
缺點：
AFLP對基因組純度和反應條件要求較高
用於遺傳作圖時,少數的標記與圖譜緊密度有出入
3、基於DNA晶元技術的分子標記
單核苷酸多態性(SNP)：是指不同個體基因組DNA序列之間單個核苷酸的差異，是第三代新型多態性標記。SNPs：單鹼基的轉換、顛換以及單鹼基的插入/缺失（Indel）目前，檢測SNP的最佳方法是新近發展起來的DNA晶元技術。晶元又稱生物集成模片、DNA陣列或寡核苷酸微晶元。目前SNP的應用非常廣泛，在人類基因單體型圖的繪製方面、疾病易感基因的相關性分析方面以及指導與藥物設計方面都有所突破。
2016年9月8日，《自然》雜誌以長文形式在線刊發了中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所國家基因研究中心韓斌研究組、黃學輝研究組聯合中國水稻研究所楊仕華研究組取得的一項成果，題為《Genomic architecture of heterosis for yield traits in rice》。
圖a是對10074個F2株系應用全基因組單核苷酸序列多態性得到的主成分分析圖。圖b是對10074個F2株系應用全基因組關聯分析對抽穗期這一性狀所作的曼哈頓圖，圖中基因為對抽穗期起主要作用SNP位點。圖c是對10074個F2株系應用全基因組關聯分析對株高這一性狀所作的曼哈頓圖，箭頭所示的位置為新確定的對株高起作用的SNP位點。
總結SNP的特點：
SNP數量多，分布廣泛
SNP適於快速、規模化篩查
SNP等位基因頻率的容易估計
易於基因分型
利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標記，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目標性狀的目的，具有快速、準確、不受環境條件干擾的優點。可作為鑒別親本親緣關係，回交育種中數量性狀和隱性性狀的轉移、雜種後代的選擇、雜種優勢的預測及品種純度鑒定等各個育種環節的輔助手段。
分子標記輔助育種在未來作物育種中的作用是勿庸置疑的。相信在不久的將來隨著分子生物技術的進一步發展以及各種作物圖譜的日趨飽和分子標記輔助育種定會發揮更大的作用。
參考文獻：
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