亮劍大魔王之二：RAS基因突變和藥物
RAS家族蛋白是一類小分子GTP酶，也是第一個在人類腫瘤中被鑒定出來的致癌基因，可廣泛參與細胞的生長、分化及腫瘤的發生和發展。RAS蛋白為膜結合型的GTP／GDP結合蛋白，位於細胞膜內側，與GTP結合時處於活化狀態；反之，與GDP結合時則為非活化狀態。
目前已知的RAS家族共有三個基因：KRAS，NRAS和HRAS。RAS酶的突變與腫瘤發生密切相關，在不同類型的腫瘤中，RAS突變類型也不同。在人類腫瘤中，KRAS突變是最為常見的，約佔85%，NRAS和HRAS分別佔12%和3%。
在美國，死亡率最高的三種癌症（胰腺癌、結直腸癌和肺癌）也恰好是RAS突變最多見的三種癌症，分別占這三種癌症患者數的95%、52%和31%。在胰腺癌、結直腸癌和肺癌中，KRAS突變占絕對多數，而NRAS突變多見於黑色素瘤和急性骨髓性白血病，HRAS突變多見於膀胱癌和頭頸癌。
不過，為什麼KRAS突變最常見，以及為何不同腫瘤中RAS突變發生幾率不一樣，目前還沒有一個很好的解釋。
三種RAS基因的突變均可能導致該酶的過度活化，即便沒有發生RAS突變，腫瘤的生成也可能因RAS上游（如EGFR）的突變而依賴於RAS活性。因此，RAS酶成為了重要的癌症治療靶點。
圖1 RAS信號通路
腫瘤對廣大的病友而言可謂是一頭兇猛野獸，一旦與其相遇，我們唯有拿出「亮劍」精神，全力搏擊，奮勇抗爭。抗腫瘤藥物就好比我們手中的武器，在鬥爭過程中，只有在恰當的時機選對恰當的武器，才有更多的機會戰勝腫瘤。
一部抗腫瘤藥物的研發史，就是一部「道高一尺魔高一丈」的鬥爭史。然而，自RAS蛋白被發現30多年以來，還沒有一個針對RAS的藥物被成功研發出來。迄今為止靶向RAS蛋白的抑製劑都是基於抑制GTP/GDP交換過程，並不能完全抑制RAS酶的活性，使得RAS蛋白一度被認為是「undruggable」的，RAS也因此被冠上了「不可藥用蛋白」的標籤。
不過，研究人員一直沒有放棄開發出RAS靶向抑製劑的努力。2013年美國國家癌症研究院（National Cancer Institute）專門提出一項倡議，對RAS「宣戰」。最近幾年對於RAS本身和RAS靶向藥物研究取得了較大的進展。
癌度跟大家繼續分享RAS靶向藥物的研究進展。（亮劍大魔王之一：RAS基因突變和藥物）
圖2 RAS的蛋白結構
抑制RAS的下游信號通路
抑制RAS下游的信號蛋白是目前吸引了最多注意力的針對RAS的藥物研發策略。不過，RAS下游已知有至少11個不同蛋白家族參與其信號傳遞，針對哪個或者哪幾個家族能產生抗癌效果是一個關鍵問題。
目前研究最集中的是兩個信號通路：RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR。因為這兩個通路中都被發現有致癌的基因突變，包括BRAF、PIK3CA和MEK。
目前的研究結果顯示，RAF-MEK-ERK通路在癌症中可能更重要一些。因為在沒有KRAS突變的少量胰腺癌中，一大部分帶有BRAF突變。
小鼠中的研究顯示，如果RAS的功能缺失，RAF-MEK-ERK信號通路中的成員能夠彌補這一點。
在RAF-MEK-ERK通路中，第一個被RAS激活的成員是RAF激酶，包括ARAF、BRAF和CRAF。
其中，BRAF抑製劑vemurafenib和dabrafenib已經獲批用於治療攜帶BRAF突變的黑色素瘤，dabrafenib和MEK抑製劑trametunib聯合用於治療BRAF突變的非小細胞肺癌。但是，這三個藥物在攜帶RAS突變的腫瘤中不起作用，主要原因是RAS突變很狡猾，抑制BRAF的同時卻能夠激活CRAF，從而使BRAF抑製劑失去抗癌作用。這就像打地鼠一樣，「按起葫蘆起了瓢」。
目前有企業正在研究第二代的泛RAF抑製劑，包括LY3009120和PLX8394，它們能夠有效抑制下游的MEK和ERK活性，避免此類現象的發生。
MEK的選擇性抑製劑，包括trametinib和cobimetinib也已經獲批用於治療攜帶BRAF突變的黑色素瘤。不過令人遺憾的是，它們對於RAS突變的腫瘤同樣不起作用。
因為在RAF-MEK的信號傳導過程中有一個反饋機制，當MEK被抑制後，細胞能夠加強RAF的活性，直到能夠克服對於MEK的抑制，充分證明了癌細胞的狡猾性，讓藥物顧此失彼。
著名的SELECT-1臨床試驗就是典型的例子，在2016歐洲腫瘤學年會（ESMO2016）上，靶向KRAS突變型非小細胞肺癌的三期臨床試驗SELECT-1宣告失敗，MEK抑製劑司美替尼聯合多西他賽未能增加患者的無進展生存期和總生存期。於是，對於RAS突變的藥物研發將目光轉向了更下游的ERK激酶，目前有多個ERK抑製劑在臨床試驗中。
PI3K-AKT-mTOR通路在腫瘤生長的過程中的作用也許是小了一些，但是它對於RAF-MEK-ERK通路有重要的補充作用。對於RAF-MEK-ERK抑製劑的抗藥性有很大程度就來自於PI3K-AKT-mTOR通路的激活。
多個藥物聯用來同時抑制這兩個通路在小鼠實驗中取得了很好的抗癌效果。但是，在人體臨床試驗中，同時抑制兩個信號通路帶來了許多副作用。目前正在研究如何協調對這兩個通路的抑制來降低毒性。
2016年，伊利諾伊大學芝加哥分校的John P O』Bryan教授和芝加哥大學Shohei Koide教授的聯合團隊取得了重要突破。
他們採用了一種類似「導彈定位定向」技術，合成出了一種抗體類似物NS1，選擇性結合到HRAS和KRAS上一個至今不為人知的結構調節位點，通過阻止上述兩種RAS活化所需的二聚化過程，達到抑制其下游信號通路活性的效果。這一成果發表於Nature子刊《Nature Chemical Biology》上。
研究者發現的這種抗體類似物NS1是一種單抗，可以高選擇性地結合HRAS和KRAS蛋白並且可以有效抑制下游ERK信號通路的激活及腫瘤細胞的轉化，但對NRAS蛋白無作用。
這項研究為通過靶向RAS來抑制腫瘤生長提供了新的思路。
在細胞系的體外轉化實驗中，NS1能夠顯著遏制HRAS、KRAS及其上游的HER2突變所引發的癌變，而對其下游的BRAF和MEK1以及NRAS的突變所引起的癌變則沒有抑制作用。
與此相符的是，當作用於HRAS發生G12V突變的人類膀胱癌細胞時，NS1可有效抑制HRAS下游ERK激酶的活化，而對表達有V600E突變BRAF的黑色素瘤細胞則沒有抑制效果。
圖3 NS1與HRAS相互作用界面
這種單抗的突出優勢在於體積小且結構穩定，可隨時通過向細胞內引入表達載體使其合成並直接作用於該細胞內的靶點，而且由於在設計時迴避了單抗內二硫鍵的形成，這些抗體類似物的活性不受細胞內氧化還原狀態的影響，因此可在更多樣的環境下穩定地發揮作用，使其成為RAS蛋白一個有效的抑製劑。
除了RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR這兩條通路，CDK抑製劑也在RAS突變的腫瘤中進行了很多探索。
CDKs和KRAS信號均在癌症發生髮展過程中起到重要的作用。CDK4/6可以通過Cyclin D磷酸化視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白，介導腫瘤細胞從G1期向S期轉化。KRAS介導的肺腺癌模型中，CDK4的活性在腫瘤進展中扮演重要角色。
CDK4和RAS聯合表達能夠誘導視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白的磷酸化，進一步導致侵襲性腫瘤的發生。更重要的是，CDK4的敲除可以導致KRAS表達的細胞選擇性衰老，這提示CDK4抑製劑可能是KRAS突變NSCLC患者的選擇之一。
Abemaciclib是CDK4/6抑製劑在K-RAS突變腫瘤臨床研究中發展最遠的一個。它是一種小分子CDK4/6抑製劑，對CDK4有更好的選擇性。
一項入組了225例患者的臨床研究，將abemaciclib應用在乳腺癌、NSCLC、膠質母細胞瘤和黑色素瘤患者中，探究了CDK4/6抑製劑在KRAS突變NSCLC患者中的葯代動力學、安全性、臨床活性等結果。
試驗結果表明：68名NSCLC入組患者，其中29名有KRAS突變。KRAS突變患者的疾病控制率為55%，野生型為39%。說明KRAS突變較野生型NSCLC患者對abemaciclib更為敏感。
在此基礎上，2014年開展了JUNIPER III期臨床研究。abemaciclib對比厄洛替尼，在既往接受過多線治療的IV期NSCLC患者中進行，主要研究終點為OS，次要終點是PFS、ORR。雖然該項研究未能達到主要研究終點。但是對照組的OS超過了根據既往數據的預期。
2017年4月，在美國癌症研究協會年會（AACR2017）上，美國Dana-Farber癌症研究所的科學家報道了一項小型研究結果。對於一些RAS驅動的肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌的患者，通過使用兩種藥物組合可以使得患者長期獲益，這兩種藥物都是抑制RAS基因下游信號通路的。
細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的抑製劑—帕博西林（palbociclib）；
MEK的抑製劑PD-0325901。
這是一項I期臨床研究，25例入組患者中的17例是KRAS突變驅動的肺癌，8例是其他癌種。1名患者的腫瘤病灶出現部分縮小，18名患者病情穩定，其中7名患者病情穩定的時間超過了6個月。
研究者在AACR大會上報道，MEK抑製劑和帕博西林的聯合使用是安全、可耐受的，而且確定有患者能從這一組合用藥中獲益。
RAS突變的合成致死相互作用
合成致死的概念被應用到了針對RAS的藥物研發中。合成致死是指通過大規模篩選尋找那些對於RAS突變的細胞存活起關鍵作用的基因，而對RAS正常的細胞不起作用。抑制那些基因時，與RAS突變產生了合成致死相互作用，對正常細胞沒有影響。
2009年時，有研究團隊報道了STK33和TBK1等幾個激酶與RAS突變有合成致死相互作用，但是進一步的研究沒有能夠證實這些作用。
傳統上的基於RNAi的合成致死基因篩選存在著特異性不高的缺陷是導致這一結果的可能原因。
最近，一些科研人員開始採用特異性更好效率更高的CRISPR技術（俗稱基因魔剪）開始尋找RAS突變的合成致死基因，取得了一些進展。
被發現的基因包括與RAS和細胞膜結合有關的RCE1和ICMT，以及能夠調控ERK-MAPK信號傳導的RAF1，SHOC2和PREX1等。不過，由於每個攜帶RAS突變的腫瘤都可能存在許多其它突變，這些合成致死基因能有多大的效果還需更多研究。
抑制RAS調控的代謝變化過程
癌細胞的一大特點是其新陳代謝與正常細胞有很大的區別，因為癌細胞需要大量的營養和能量來支持其快速的生長過程。最近的一些研究顯示RAS突變調控了其中一些過程，如果能夠抑制這些過程，也有望抑制RAS突變腫瘤的生長。
RAS突變激活巨胞飲作用
巨胞飲作用是細胞內吞作用的一種，通過巨胞飲作用，癌細胞從細胞外獲取營養物質和水。來自紐約大學醫學院的研究人員在一項具有里程碑意義的癌症新研究中，揭開了一個長期未解的謎團：RAS突變的胰腺癌是如何養活自身的？
在這項研究中，研究人員第一次揭示了RAS癌細胞利用巨胞飲過程，吞噬白蛋白，並利用其生成生長必需氨基酸的機制。研究結果表明，RAS癌細胞尤其依賴於巨胞飲維持生長和生存。所以，靶向抑制巨胞飲作用、阻斷這一營養輸送過程就成為了藥物研發的一個思路。
目前並沒有能夠直接抑制巨胞飲作用的藥物，但是，有一個鈉離子/氫離子交換通道的抑製劑EIPA能夠間接抑制巨胞飲作用，有證據顯示它能夠減緩胰腺癌的生長。
另外，巨胞飲作用獲取的營養成分中很重要的一種是白蛋白，它可以作為氨基酸的來源。如果使用一些能夠與白蛋白特異結合的，攜帶化療藥物紫杉醇的納米顆粒，可以將紫杉醇直接送入癌細胞內，也許能取得一定的抗癌效果。
RAS突變的自噬作用
RAS突變的癌細胞獲取營養的另一種方法是自噬作用，癌細胞可以通過它來獲取生長所必需的氨基酸、脂質和核酸等。
氯喹類的抗瘧葯對於自噬作用有抑制效果，並且對於巨胞飲作用也有一定的抑制效果。氯喹在一個小鼠胰腺癌模型中取得了不錯的效果，目前有一項臨床試驗正在評估羥氯喹在胰腺癌中的潛在療效。
此外，攜帶RAS突變的胰腺癌細胞被發現更依賴於從谷氨醯胺產生的NADPH，NADPH對於維持細胞內的氧化還原平衡起關鍵作用。正常細胞主要從葡萄糖產生NADPH，因此，抑制從谷氨醯胺產生NADPH的化學過程能夠特異性針對癌細胞。
目前，有一個抑制這個過程中的第一步谷氨醯胺酶的小分子藥物CB-839正在臨床試驗中，用於評估其對白血病和多種腫瘤的效果。抑制這個過程中的其它參與者的藥物也有多個在臨床前研究中。
近期發表在《Nature Medicine》上的一項研究指出一種新的策略來阻止KRAS突變的腫瘤，來自麻省理工學院科赫綜合癌症研究所的研究人員發現了KRAS基因有一個弱點，利用這一弱點可以將癌細胞餓死。
在KRAS突變的小鼠模型中，研究人員發現存在另一種叫做Keap 1的突變基因時，小鼠體內的腫瘤生長得更快。
事實證明，Keap 1基因限制了腫瘤內的抗氧化和抗炎反應，這兩種基因保護腫瘤細胞免受可能導致其死亡的損傷。只要Keap 1突變存在，這種保護性響應就持續進行；如果有藥物能阻斷谷氨醯胺的供應，就能有效遏制Keap 1突變，腫瘤就不能繼續生長，被稱為CB-839的藥物，在小鼠模型的試驗中證實了這一點。
這一發現對臨床潛在的新治療方法有指導作用。目前正在申請人體臨床實驗。
--- 總結和展望 ---
兵法雲，「知己知彼，百戰不殆」。三十多年的深入研究讓我們對RAS突變的了解越來越深。儘管過去二三十年對於RAS的藥物研發過程非常曲折，但是整個領域對前景仍然感到樂觀，針對RAS的藥物在不久的將來應該就會出現。不過我們對於RAS的功能以及RAS突變致癌的機理仍然沒有完全清楚，這意味著在這個領域仍然很有可能出現更多失敗的例子。
有一點可以肯定的是，針對RAS的藥物將不可避免地向個體化發展，出現一個對所有RAS突變都有效的藥物幾乎是不可能的。針對不同腫瘤中的不同RAS蛋白，甚至不同的RAS突變，都將會有不同的藥物。
隨著越來越多的科學家加入RAS研究的領域，藥物研發的過程也將會被加快。從目前來看，針對RAS下游信號通路的抑製劑有望最早獲得成功，因為這一部分已經有多個藥物進入了臨床試驗。從長遠來看，直接抑制RAS的藥物很有可能是最有效的。
隨著癌症免疫療法的迅速發展，RAS和腫瘤免疫之間的關係會將是一個研究熱點。此外，通過RNAi或CRISPR技術直接抑制RAS突變基因的表達也有很大的潛力。
總而言之，雖然制定有效的RAS依賴性癌症治療策略的任務依然是一項艱巨的任務，但是有了新的知識和策略，對於一項超高難度的任務而言，可能會變成能完成的使命，我們要有謹慎樂觀的態度，對於最終戰勝RAS突變要充滿信心。
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