CRISPR技術重大突破，大規模篩庫將成為可能
iNature：使用CRISPR-Cas9的組合遺傳篩選是發現冗餘基因和探索複雜基因網路的有用方法。然而，目前的方法受到單引導RNA（sgRNA）和有限基因靶向活性之間的干擾。為了提高組合篩選的效率，Doench研究組使用來自金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的直系同源物Cas9酶。Doench研究組使用機器學習來建立金黃色葡萄球菌Cas9 sgRNA設計規則，並將金黃色葡萄球菌Cas9與化膿性鏈球菌Cas9配對，以在細胞中實現雙重靶向。Doench研究組還開發了慢病毒載體和克隆策略，以生成高複雜度的彙集雙敲除文庫，以確定多種細胞類型，包括MAPK通路基因和凋亡基因的合成致死和緩衝基因對。Doench研究組的直系同源方法還使得能夠將基因敲除與轉錄激活結合起來，這揭示了與TP53的遺傳相互作用。這裡描述的「大Papi」（配對的金黃色葡萄球菌和化膿性互作用）方法將被廣泛地應用於組合表型的研究。
繪製基因之間的功能關係是理解疾病狀態如何由基因功能障礙引起的關鍵步驟。在酵母中，高通量的方法使得遺傳網路的創建成為可能，有2300萬個雙突變體可以鑒定近100萬個相互作用【1-4】。在人類細胞中，網路的複雜性要比酵母高出幾個數量級，蛋白質編碼基因和成千上萬種不同的細胞類型的成對組合大約有10倍以上。
系統構建
RNA干擾（RNAi）和CRISPR技術可以同時干擾兩個或更多的基因，從而代表一個有前途的方法來揭示遺傳相互作用。現在可以使用慢病毒構建系統進行初始組合CRISPR篩選【5，6】。然而，包括U6啟動子在內的慢病毒載體中的重複元件導致高水平的重組，並降低組合篩選效率【7-10】。儘管另一項研究發現化膿性鏈球菌tracrRNA序列的多個拷貝，同樣傾向於重組【11】，但是實現組合CRISPR篩選的兩個努力使用了來自小鼠和人的直系同源U6啟動子。最後，因為Cpf1酶處理自己的轉錄本，他們可以從一個轉錄本提供多個sgRNAs。然而，在同一個單元中，多個indel的報告效率低於10％，對篩選應用來說太低。在所有情況下，不同的RNA可能競爭載入到一個共同的效應酶，導致整體效率下降【12-14】。
應用推廣
Doench研究組開發了一種方法，依靠來自釀膿鏈球菌和金黃色葡萄球菌（SpCas9和SaCas9）的正交Cas9酶來克服以前方法的實際限制，並實現穩健篩選的雙敲除效率。 這種方法揭示了跨越多種細胞類型的合成致死和緩衝關係，以及針對相同基因對的獨特sgRNA對之間的良好對應性。 由於兩個sgRNA獨立編程兩個不同的Cas9，這種方法可以在同一個屏幕上結合不同的活動，如敲除和過表達（CRISPRa）【15】。 Doench研究組預計，大規模組合空間（稱為Big Papi）的效應器將在許多模式生物中廣泛應用。
https://www.nature.com/articles/nbt.4048
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