2017Nature：衰老與癌症中細胞漿染色質激發炎症
編者按：新年新氣象！表觀奇譚2018年第一期JC迫不及待的與大家見面啦！這期JC介紹的內容是來自Shelley Berger（美國賓西法尼亞大學）與Peter Adams（英國Glasgow大學）兩個實驗室合作發表在Nature雜誌（2017年10月online）的一篇研究論文——Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer。這篇論文講述了衰老與癌癥狀態下細胞漿染色質（沒錯！本應在細胞核里的染色質流竄到了細胞漿）作為一種危險信號激活先天免疫的cGAS-STING通路啟動促炎症基因表達的精彩發現。
Brief Introduction
摘要
一、細胞衰老時胞漿染色質片段（CCF）激活cGAS-STING通路
作者採用了三種誘導IMR90原代人成纖維細胞衰老的方式（過表達HRasV12、DNA損傷藥物Etoposide處理、複製衰老），免疫熒光顯示細胞核外周可見遊離的微核樣染色，這些位置rH2AX與cGAS染色也呈現強陽性，提示細胞衰老過程出現了微核樣的胞漿染色質，並且能夠被cGAS識別。
胞漿DNA的感應分子cGAS具有產生cGAMP第二信使的活性，作者通過液相色譜聯用質譜的技術檢測到過表達HRasV12與轉染90-mer雙鏈DNA一樣均能生成符合cGAMP預期大小的液相與質譜峰。非變性膠Western印跡檢測也可以檢測到STING二聚體的生成。此外，作為細胞衰老的標誌物p16的表達增加、Lamin B1的表達減少、IL1a的表達增加。
二、CCF-cGAS－STING通路促進SASP（senescence-associated secretory phenotype）
為了進一步闡明cGAS-STING通路在細胞衰老中的功能，作者採用shRNA敲低了cGAS或STING的表達（a），通過Western印跡與檢測了敲低cGAS或STING對細胞衰老相關基因表達的影響，其中「LaminB1表達減少」、「p16表達增加」、CyclinA表達減少」的現象並不受影響，而「促炎基因IL1a與IL8表達增加」的現象則完全消失（b&c）。此外，作者還進一步通過RNA-seq檢測了敲低cGAS後對基因表達的影響，其中下調的基因富集在細胞因子活性、生長因子活性、CXCR趨化因子受體結合、趨化活性等GO科目上。
RNA-seq數據的基因截圖顯示細胞衰老相關的IL1a與IL1b的表達增加現象在cGAS敲低之後消失。細胞因子抗體晶元檢測結果也發現多種細胞因子的蛋白表達受到cGAS或STING基因敲低的影響，這些結果提示細胞衰老過程的SASP現象是cGAS-STING通路依賴的，並且更下游可能是通過NFkb（p65）來實現的。
三、STING介導小鼠體內的SASP
上述實驗都是體外培養的原代人成纖維細胞中得到的結果，作者又進一步在小鼠體內進行了檢測。他們使用了STING基因敲除的小鼠，靶器官是肝臟。
首先採用的是電離輻射誘導細胞衰老，rH2AX免疫組化檢測結果顯示WT與STING KO小鼠肝臟在輻照後都呈現大量陽性細胞，提示DNA損傷發生。而IL1a的免疫組化結果則提示只有WT小鼠肝臟可見IL1a表達，而STING KO小鼠則很少。輻照後WT小鼠呈現大量毛髮灰白的外觀，而STING KO小鼠則沒有這個現象。
此外，作者還採用了過表達NRasV12的轉座子體系直接注射到小鼠肝臟，從而在肝細胞中誘導細胞衰老，免疫組化顯示在早期NRas陽性細胞比例兩種基因型小鼠沒有顯著區別，但隨著時間延長，WT小鼠中NRas陽性細胞比例逐漸減少，但STING KO小鼠中依然大量存在。RT-qPCR檢測結果顯示WT小鼠肝臟組織炎症因子表達水平顯著高於STING KO小鼠肝臟組織，而免疫細胞的標誌基因表達則相反，提示STING KO小鼠喪失了對NRasV12過表達誘導的衰老細胞相關炎症反應以及繼發的免疫清除效應。通過小動物活體熒光成像技術也可檢測到NRasV12陽性細胞在WT與STING KO小鼠肝臟中的命運變化。八個月後開腹腔可見STING KO小鼠的肝臟出現了肝癌組織。
四、在衰老逃逸與癌症中CCF介導的促炎應答
由於衰老是細胞對抗癌變的一種自我保護手段，突破衰老限制是癌症發生的重要環節，作者進一步檢測了衰老細胞逃逸之後CCF-cGAS-STING通路是否還發揮作用。
作者通過在過表達HRasV12的原代人成纖維細胞中導入SV40與hTERT來幫助細胞突破衰老的限制。儘管細胞衰老的SA-b-Gal染色結果顯示突破衰老之後的細胞染色為陰性、衰老相關的異染色質結構也消失了，但CCF-cGAS-STING通路依然激活，促炎因子的表達水平也與衰老細胞相當。
作者進一步對大量（～1000種）不同類型細胞的RNA-seq資料庫進行了分析，同樣也發現STING高表達的細胞系中促炎因子基因的平均表達水平顯著高於STING低表達的細胞系。因此，無論是衰老細胞、突破了衰老限制的永生化或癌細胞，細胞漿染色質片段（CCF）都能夠通過cGAS-STING通路激活促炎基因的表達。
總結全文，細胞漿染色質片段（CCF）是一種「危險」的信號，可以激發先天免疫的防禦系統，促進機體免疫清除這些損傷的細胞。
P.S.：這個研究方向競爭非常新穎但也異常激烈，差不多同時間Nature Cell Biology與PNAS也分別發表了相似發現的文章。
Nature Cell Biology這篇來自Andrea Ablasser實驗室：
PNAS這篇來自陳志堅實驗室：
Post-publication peer-review comments
一、Lee的評論
非常漂亮的工作！我大致對比了這篇Nature與同期發表在Nature Cell Biology與PNAS上的另外兩篇文章，這三篇文章都從體外的原代細胞模型做到了體內基因敲除小鼠實驗。Nature和PNAS這兩篇還對TCGA臨床標本數據進行了分析，證明這條通路在腫瘤中的意義。但在具體細節上有些矛盾，NCB和PNAS那兩篇文章發現cGAS-STING通路顯著影響細胞衰老，而這篇Nature則認為這條通路僅影響了細胞衰老相關的促炎基因表達這一方面（即：SASP）。
我個人認為這篇Nature文章的理論水平要更勝一籌：因為前兩篇還只停留在細胞衰老這單一生物學現象上，而這篇Nature顯然眼光要更高一層，不僅看到了細胞衰老，還看到了衰老逃逸、免疫清除與癌症發生。
二、wsherryw的評論
本文主要研究在細胞衰老過程中由於laminB缺失產生的CCF進入到細胞質中激活cGAS-STING pathway進而引起下游一系列的反應，即基因組DNA在衰老和炎症細胞中對促炎因子的激活作用，通過靶向細胞質染色質介導的促炎途徑對治療炎症相關病症有指導意義。
這篇文章值得我學習的地方有很多，比如在蛋白水平研究KD了STING後下游一下趨化因子的表達情況以及動物實驗、使用transposase研究干擾素通路。
研究人員僅通過共定位等手段就說明CCF激活cAGS- STING pathway，即「CCF activates cGAS–STING pathway in cellular senescence」我覺得不夠充分。
總體來說這篇文章邏輯嚴謹，學到了不少東西。
三、Lv的評論
這篇文章講述了在細胞衰老過程中，細胞會由於cell-cycle arrest等一些原因從細胞核釋放一些染色質片段到細胞質中，作者發現胞質中的染色質片段可以在細胞衰老過程中誘導先天免疫反應從而激活可以感受胞質DNA的cGAS-STING通路，從而導致短期以及慢性炎症反應，促進細胞分泌一些細胞因子等。另外，作者還在小鼠中通過敲除STING發現抑制cGAS-STING通路小鼠的免疫清除損傷或癌變細胞功能會受到影響。另外，作者還通過對TCGA等癌症公共資料庫的挖掘證明，在癌症中cGAS-STING通路與炎症反應的發生具有一定的相關性。總體來講，這篇文章通過一系列的實驗證據證明了細胞衰老或者癌變過程中，釋放到胞質中的染色質片段可以通過cGAS-STING通路誘導炎症反應。
但個人感覺本文在證明CCF介導細胞衰老過程中的炎症反應中還是缺少直接的證據，只是證明了起存在相關性，即細胞衰老過程中，在胞質中會出現染色質片段，並且cGAS-STING通路會激活，同時出現炎症反應表型，並沒有證明其因果關係。本人覺得，如果作者能通過轉染或者其他什麼方法把同細胞系的染色質片段轉入胞質中，觀察是否會激活cGAS-STING通路，以及後續的炎症反應會更有說服力。
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