《Science》長文帶您一覽30年來基因編輯技術發展！

基因編輯

在20世紀80年代始，基因編輯技術開始不斷發展。而在CRISPR基因編輯技術橫空出世之後，基因編輯技術有了突飛猛進的發展。而在近日，《Science》發表長文，列出了近年來基因治療史上的一些重要突破。

在剛剛過去的2017年，美國FDA首次批准了兩種針對血液疾病的CAR-T細胞免疫療法和一種針對眼科遺傳病的療法Luxturna。1月12日，Cynthia E. Dunbar等六名科學家聯名在《Science》上以《Gene therapy comes of age》為題發表了綜述，文中論述了基因治療史上的幾大重要進展，並展望了基因治療的未來。今天小編據此文整理了基因治療發展史上的重大進展，以饗讀者。

新的基因載體

隨後慢病毒和泡沫病毒加入了載體庫。慢病毒載體能使基因轉移進入不分裂的細胞，與g-逆轉錄病毒載體相比，慢病毒載體可以攜帶更大更複雜的基因盒，因此為血液病的治療提供了巨大助力。慢病毒載體和泡沫病毒載體還有另一優點，它們會優先整合到基因的編碼區，這一特性有效避免了造血細胞中潛在的同基因插入誘變的風險。慢病毒載體是目前大多數HSC應用的首選工具，但是g-逆轉錄病毒載體在T細胞工程和HSC基因治療中仍有所應用。

同時科學家們還試圖去除慢病毒和g-逆轉錄病毒載體中的內源性強化元件，使用「自滅活」SIN設計降低遺傳毒性風險。這個設計目前被用於大多數臨床試驗。

腺相關病毒（AAV）載體是從天然複製缺陷型非致病性非包膜細小病毒構建的。野生型AAV需要通過另一種病毒如腺病毒或皰疹病毒來複制。AAV載體的一個缺陷是它們不能包裝大於?5.0kb的DNA（而g-逆轉錄病毒載體或慢病毒載體可以容納8kb）。AAV載體主要是非整合性的，其將轉移的DNA作為附加體保持穩定。這一特徵降低了整合的相關風險，但也限制AAV載體在有絲分裂細胞中的長期表達。

新的基因編輯技術

2009年的實證表明，細菌蛋白質的轉錄激活劑樣效應子（TALEs）很容易被改變，從而為TALE核酸酶（TALENs）的創造打開了大門。這些酶可以有效地切割任何DNA序列。然而，TALEN法仍需為每個DNA設計一對特定的核酸酶。

2012年，基因組編輯格局發生了變化。Doudna和Char-pentier發現CRISPR-Cas9核酸酶組成的細菌防禦系統可以通過設計與目標位點互補的特定短指導RNA（gRNA）來切割DNA。CRISPR-Cas9核酸酶技術迅速應用到哺乳動物細胞中，從而簡化了編輯過程。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶實現了快速重新編程，現在廣泛用於基礎研究中。基因組編輯技術為修正或改變基因組提供了精確的解剖刀，並且克服了依靠病毒載體介導的半隨機基因組插入的缺點。

基因組編輯進入臨床的步伐越來越快。工程化的鋅指核酸酶（ZFNs）已被用於破壞人類T細胞和HSCs中的CCR5（C-C基序趨化因子受體5型）的表達，幫助這些細胞抵抗HIV感染。 TALEN已被用於製造可防止移植物抗宿主病（GVHD）的CAR-T細胞。

此外，在急性骨髓性白血病和漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤中，TALEN編輯的CAR -T細胞的早期試驗已經開始。同時，美國食品和藥物管理局（FDA）已批准啟動三項ZFN介導的治療性基因體內插入肝細胞白蛋白基因座的臨床試驗，目的是為血友病B患者提供IX、aL 基因，並為II型粘多糖病（MPS II）患者提供艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因。體內基因組編輯治療的第一位參與者最近參加了MPS II試驗，通過AAV靜脈輸注，實現肝臟基因組的精準編輯。

另外，中國的監管機構也已經批准了至少九個CRISPR-Cas核酸酶的試驗，主要是為了敲除腫瘤T細胞中的PD1表達，據報道已有幾個試驗入選了患者。

需要強調的是，與標準的基因轉移方法相比，基因組編輯（特別是CRISPR-Cas核酸酶）仍處於其實驗和臨床初期階段，仍存在一些潛在的可行性和安全性問題，可能會影響臨床應用，這問題將需要進一步的臨床前研究、適當的模型和精心設計的臨床試驗來一一克服。

單基因血液疾病和癌症的免疫療法

20世紀90年代後期和21世紀初，研究人員使用g-逆轉錄病毒載體對T細胞進行基因編輯，引起編碼白細胞介素-2受體或腺苷脫氨酶的基因的功能喪失，突結果顯示重症聯合免疫缺陷（SCID）患者的免疫功能明顯改善。儘管g-逆轉錄病毒載體的HSC轉導效率相對較低，但基因修飾的T細胞依舊能夠擴增並填充T細胞區室。慢病毒載體獲得的HSC的高轉導效率使得基因治療方法更廣泛地應用於血液疾病和腫瘤的治療。

另外，載體生產方法的優化，離體HSC操作和移植前細胞減滅術都有助於臨床獲益。慢病毒基因治療的臨床試驗結果令人興奮，在腎上腺腦白質營養不良的臨床試驗中，亦首次報道使用慢病毒載體進行的HSC基因治療。目前已經開發了含有多種調節元件的慢病毒載體，其多中心臨床試驗正在進行。類似地，破壞基因組位點模擬的與遺傳性白血病相關的遺傳變異體，也有希望成為治療鐮狀細胞性貧血的HSC基因組編輯的靶點。

另外CD19 CAR-T在難治性急性淋巴細胞白血病（ALL）和瀰漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)中的臨床益處令人眼前一亮，2017年FDA就批准了兩種基因工程細胞產品。目前的研究旨在將CAR治療擴展到骨髓惡性腫瘤和實體瘤。此外，還需要促進CAR-T細胞進入大腫瘤或免疫特異性位點的方法學，了解T細胞的腫瘤微環境信號。CAR-T細胞對某些癌症的治療有很大的影響，這為未來基於T細胞的治療方法提供了基礎。

過去的一年中，基因組編輯方面的進展一度突飛猛進，來自多個臨床試驗的成熟數據的發表顯示了各種嚴重人類疾病的基因疫苗的有效性和安全性。在政府和慈善機構的支持下，從事基礎研究和臨床研究的科學家與臨床醫生將繼續創新並提供新的或改進的技術。生物技術和製藥行業越來越多地參與基因治療，顯示了該領域的成熟，並且有必要加速這些治療手段的交付。但目前仍然存在許多挑戰，例如通過整合基因遞送載體或脫靶基因組編輯來處理基因毒性，將基因轉移或編輯效率提高到能夠有效治療疾病的水平，解決重複體內施用載體引起的免疫應答，就有關爭議的問題達成社會共識等等。未來，基因治療將為人類健康帶來的持久效益，這種療法也將成為我們的標準治療的一部分，我們堅信。

參考資料：Gene therapy comes of age

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