CAR-T專利面面觀
CAR-T細胞療法是一種過繼細胞療法 (adoptive cell therapy)。2017年，Novartis和Kite的兩款CAR-T產品相繼獲批給細胞治療領域的研究者注入了一劑強心劑。作為一種「產品」，圍繞CAR-T的專利壁壘可能存在於整個生產過程的哪些環節中呢？我們嘗試在本篇中進行一些探討。
CAR-T專利面面觀
by
TiPLab 木桃
CAR-T細胞療法
CAR-T細胞是一種經基因工程化的T細胞，通常表達能識別特定腫瘤抗原的CAR (chimeric antigen receptors，嵌合抗原受體)，進而激活免疫系統以消滅腫瘤。CAR通常包含三個結構域：識別腫瘤相關抗原的胞外域 (如，scFv)、信號傳導結構域 (例如，CD3 zeta)和一個或多個胞內共刺激結構域 (例如，可源自CD28、4-1BB、OX40等)。
CAR-T細胞設計，圖片來源： Nature reviews Clinical oncology 13(6), 2016
目前，CAR-T主要用於治療血液腫瘤 (如B細胞惡性腫瘤)，其中靶向CD19的CAR-T療法已取得了激動人心的治療效果，而人們也在嘗試用CAR-T來治療其它類型的血液腫瘤，甚至實體瘤。
2017年8月和10月，FDA相繼批准了Novartis和Kite的CAR-T產品KYMRIAH(tisagenlecleucel)和YESCARTA(axicabtagene ciloleucel)，這兩款產品都是靶向CD19的CAR-T細胞。
目前FDA已經批准的兩款產品都是利用患者自身的T細胞進行修飾的，這種方法的優點是較少出現免疫原性問題，製備過程可以簡單描述如下：
將來自患者自身的T細胞在離體 (ex vivo)條件下經過基因工程的方法進行修飾和擴增後得到所需的CAR-T細胞，然後回輸至患者體內。主要包括以下步驟：
步驟1：利用白細胞分離術收集白細胞，進一步分離並富集T細胞
步驟2：培養步驟1中獲得的T細胞，利用人造抗原呈遞細胞活化T細胞，並施加裝載有CAR核酸序列的病毒載體
步驟3：在生物反應器中擴增T細胞
步驟4：對擴增產物進行洗滌並濃縮
步驟5：經過質控和審查後，對產品進行冷凍保存
步驟6：產品經解凍輸注至患者體內
CAR-T細胞製備過程，圖片來源：Nature Reviews Cancer 16(9), 2016.
下面我們就以中國的專利保護情況為例，來看看上面這個過程中可能在哪些環節存在何種專利壁壘。
CAR-T相關的中國專利
T細胞富集環節
「一種富集CD4+或CD8+T細胞的方法，所述方法包括： (a) 在封閉系統中進行第一選擇，所述第一選擇包括:從包含原代人Τ細胞的樣品中針對 (i)CD4+細胞和 (ii)CD8+細胞之一進行富集，所述富集由此產生第一選擇群和未選擇的群;和 (b) 在所述封閉系統中進行第二選擇，所述第二選擇包括:從所述未選擇的群中針對 (i)CD4+細胞和 (ii)CD8+細胞中另一者進行富集，所述富集由此產生第二選擇群，其中，所述方法產生富集的組合物，其針對CD4+細胞和CD8+細胞富集，並且包括第一選擇群的細胞和第二選擇群的細胞。」
可見，該方法涉及如何從人Τ細胞的樣品中，分別針對CD4+細胞和CD8+細胞進行篩選和富集。
病毒轉導環節
Juno的另一個中國專利申請CN107109438A涉及病毒轉導方法。其中，權利要求1如下：
「一種轉導方法，其包括:在離心室的內部空腔中孵育輸入組合物，該輸入組合物包含細胞及含有重組病毒載體的病毒顆粒，其中該離心室能圍繞旋轉軸旋轉，並且包含端壁、自該端壁延伸的基本上剛性側壁及至少一個開口，該側壁的至少一部分包圍該內部空腔，且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空腔中及液體自該空腔壓出；該離心室在該孵育的至少一部分期間圍繞該旋轉軸旋轉；及該方法產生輸出組合物，該輸出組合物包含用該病毒載體轉導的多個細胞。」
這個權利要求描述的就是一種在特定裝置中，用病毒轉導細胞的方法，最後獲得經轉導的細胞。
細胞擴增環節
再來看一個Juno的中國專利申請CN106414724A，其涉及一種細胞擴增方法，權利要求1如下：
「一種擴增細胞群的體外方法，其包括使包含細胞群的樣品與多聚化劑接觸，其中，所述多聚化劑具有可逆固定(結合)於其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑；其中，所述多聚化劑包含至少一個結合位點Z1用於第一試劑的可逆結合，其中，所述第一試劑包含至少一個結合配偶體C1，其中所述結合配偶體C1能夠與多聚化劑的結合位點Z1可逆結合，其中所述第一試劑通過結合配偶體C1和結合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結合，以及其中，所述第一試劑與細胞表面的受體分子結合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞。」
可見，這個權利要求描述的是利用多聚化劑來激活細胞，從而使細胞群擴增的方法。
CAR或CAR-T
CAR的結構組成決定了T細胞結合的抗原種類，進而刺激T細胞發揮治療作用，因此，圍繞「CAR」和載入了「CAR」的T細胞的專利申請可謂是最重要的一類專利。
「編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離核酸分子，其中該CAR包含包括人源化抗CD19結合結構域的抗體或抗體片段、跨膜結構域、和包含刺激結構域的胞內信號傳導結構域，其中所述抗CD19結合結構域包含表3所列任何抗CD19輕鏈結合結構域氨基酸序列的輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)和輕鏈互補決定區3(LC CDR3)之一個或多個、以及表3所列任何抗CD19重鏈結合結構域氨基酸序列的重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2 (HC CDR2)和重鏈互補決定區3 (HC CDR3)之一個或多個。」
可見，其限定了CAR包含結合CD19抗原的人源化結合結構域的抗體或抗體片段，並進一步限定了輕鏈和重鏈的序列。
「分離的嵌合抗原受體(CAR)，其包括抗原結合結構域、共刺激信號傳導區和CD3ζ信號傳導結構域；其中所述抗原結合結構域結合腫瘤抗原，所述腫瘤抗原選自CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任何組合；和/或所述共刺激信號傳導區包括共刺激分子的細胞內結構域，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合的配體和其任何組合。」
可見，該權利要求中，對抗原結合結構域和共刺激信號傳導區的限定都相當寬泛，相信後續審查過程中將通過修改進一步限定。
賓夕法尼亞大學的另一個中國專利申請CN107206024A涉及一種經修飾的T細胞，其權利要求1如下：
「修飾的T細胞，其包括：能夠下調內源基因的基因表達的核酸，所述內源基因選自TCRα鏈、TCRβ鏈、β-2微球蛋白、HLA分子、CTLA-4、PD1和FAS；和編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受體(CAR)包括抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激分子的胞內結構域。」
可見，該專利申請涉及的是通用型CAR-T (allogeneic CAR-T)細胞，其中通過下調某些內源基因的表達而降低免疫原性，以期提供「off-the-shelf」的CAR-T產品。
「一種製備用於免疫療法的T細胞的方法，包括：(a)通過滅活至少以下各項改變T細胞：表達免疫抑製劑的靶標的第一基因，和編碼T細胞受體(TCR)的組件的第二基因，(b)可選地在所述免疫抑製劑的存在下，擴增所述細胞。」
滅活表達免疫抑製劑靶標的基因是為了提高工程化T細胞對免疫抑製藥物的耐受性，而滅活編碼TCR的組件的基因是為了降低移植物抗宿主反應，這些都為通用型CAR-T細胞的應用奠定了基礎。
質控環節
賓夕法尼亞大學遞交的另一個中國專利申請CN104619723A涉及分析基因修飾的T細胞中污染物的方法，其權利要求1如下：
「分析基因修飾的T細胞以檢測污染物的方法，其中所述基因修飾的T細胞包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸，其中所述CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號傳導區和信號傳導結構域。」
可見，該方案涉及的是對所獲得的細胞產品進行質量控制的方法。
治療方法、用途及藥物組合物
「一種包含用於治療對象中疾病或病症的表達嵌合抗原受體(CAR)的細胞的組合物，其中所述細胞經配製和/或包裝用於以第一和連續劑量給予對象和/或所述治療包括以第一和連續劑量向對象給予細胞，其中：
所述第一劑量包含不超過約1x106個細胞/千克對象體重，不超過約1x108個細胞，和/或不超過約1x108個細胞/m2對象，並且
所述連續劑量選自：
i)用於在以下時間點給予的連續劑量：(a)第一給予開始後至少或超過約14天後並且不到約28天，和/或(b)(i)所述對象中指示細胞因子釋放綜合征(CRS)的因子的血清水平是所述第一給予之前即刻的所述對象中的不到約10倍，不到約25倍，和/或不到約50倍；(ii)所述對象沒有顯示3級或更高神經毒性；(iii)所述給予第一劑量後所述對象中的神經毒性的癥狀或CRS-相關結果已經達到峰值水平並且在所述第一給予之後開始下降，和/或(iv)所述對象沒有顯示針對所述第一劑量的細胞表達的CAR的可檢測的體液或細胞介導的免疫應答；和
ii)包含與第一劑量中的CAR-表達細胞的數量大約相同數量的CAR-表達細胞的連續劑量，或與第一劑量相比數量增加的CAR-表達細胞的連續劑量。」
由於治療方法在中國是非授權主題，權利要求寫成上述模樣也真是挺難為專利律師的。
組合拳
上面介紹的多是涉及生產的某個環節的專利，而Kite的中國專利申請CN106459915A則涉及了從細胞富集到細胞擴增的整個製備過程，例如，權利要求1如下：
「一種製造表達細胞表面受體的T細胞的方法，所述細胞表面受體識別靶細胞表面特定抗原部分，所述方法包括：富集獲自供體對象的淋巴細胞群體；用一種或多種T細胞刺激劑刺激所述淋巴細胞群體，從而產生激活的T細胞群體，其中所述刺激是使用無血清培養介質在封閉系統中進行的；用包含編碼所述細胞表面受體的核酸分子的病毒載體對所述激活的T細胞群體進行轉導，使用單循環轉導以產生轉導的T細胞群體，其中所述轉導是使用無血清培養介質在封閉系統中進行的；對所述轉導的T細胞群體擴增預定的時間以產生工程化T細胞群體，其中所述擴增是使用無血清培養介質在封閉系統中進行的。」
雖然，大部分CAR-T領域的中國專利申請尚未獲得授權，但鑒於主要玩家們在其它國家和地區的專利糾紛不斷，在中國進行CAR-T研發的企業們還是應該密切關注各個生產環節中的重要專利，儘早鑒別出可能的法律風險併合理應對。此外，該領域的現有技術狀況錯綜複雜，專利申請非常密集，進行CAR-T研發的企業在相關專利申請和布局方面，也應只爭朝夕。
* 以上文字為TiPLab原創，首發於生物製藥小編
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