當前位置:
首頁 > 最新 > BSA+RNA-seq:多組學高效篩選目標基因

BSA+RNA-seq:多組學高效篩選目標基因

發表期刊:《Frontiers in Plant Science》

發表時間:2017.12

合作單位:青海大學

研究背景

過去的幾十年里,分子標記一直在目標基因定位和選擇育種中扮演著重要的角色,但是,不同的群體基因定位的效果不同,有些群體很難進行連鎖作圖,如本研究中甘藍型油菜近等基因系(near isogeniclines, NILs)未能成功定位到基因組區間。

NGS技術的發展可以彌補上述的不足,促進植物分子育種的發展。全基因組重測序中常常運用BSA(Bulked Segregant Analysis)混合群體分離分析法,主要將兩個具有極端性狀的群體進行混池測序,比較兩個群體在多態位點(SNP)的Allele Frequency(AF)是否具有顯著差異,從而達到定位性狀相關基因和位點的目標。

RNA-seq幾乎可以得到所有基因的表達量(包括低丰度的基因),能夠很好的研究大量基因表達變化,也可以發現新的基因和SNP位點。

研究目的

油籽類作物的雌蕊和雄蕊發育在授粉和油菜產量過程中發揮著關鍵性的作用,然而影響雌蕊和雄蕊發育的分子機理仍未研究清楚。

目前,雄性不育普遍存在,一些作物中也發現了雌性不育,但是雌雄同時不育作物很少報道。本文通過甘藍型油菜雌雄不育系統中,對不育和可育兩種表型群體進行BSA和RNA-seq,旨在篩選油菜育性相關的基因和位點,為雌雄不育基因的克隆奠定基礎。

研究樣本

通過油菜種間雜交獲得突變體F1(正常可育),F2表現出性狀分離。再不斷自交培育,獲得近等基因系(near isogenic lines, NILs),包括不育和可育兩種表型,作為研究材料(圖1)。

圖1.突變群體構建示意圖和兩種表型花蕾(A-K不育;a-k可育)

研究思路

研究結果

1

不育和可育表型的遺傳分析

在早期開花時,分析F7?F9代花蕾的可育性,結果顯示可育:不育呈現3:1性狀分離規律,說明不育的性狀主要由一個隱性基因控制。

表1. 表型的遺傳分析

2

全基因組重測序(BSA分析)

總共得到47.25G的raw data和46.80 G的clean data,兩個樣本的平均reads覆蓋深度24.99× 至26.20×。clean data比對基因組後,可育和不育pool大約鑒定到2,813,972個SNPs。通過計算SNP index和ΔSNP index發現候選基因可能位於3號染色體(C3)上的3個不同基因組區間 (35.40?35.68,35.74?35.75和45.34?46.45Mb)(圖2)。

圖2. SNP index和ΔSNP index曼哈頓圖

3

遺傳標記和連鎖分析

基於BSA測序結果,針對C3區域設計(圖3A)64個InDel markers,結果顯示6個marker在514個不育樣本(F7和F8)中有多肽性。連鎖分析顯示這些makers有一定重組並且位於C3的45.34?46.45 Mb區域,排除了另外兩個區域,縮小了候選基因的區域範圍(圖3b)。

圖3. 鑒定油菜育種相關基因。(A)ΔSNP index顯示C3候選區域;(B)基於分子標記的連鎖分析驗證候選基因基因組位置;(C)BSA,RNA-seq和連鎖分析鎖定目標基因。

4

RNA-seq

對可育和不育油菜花花蕾進行RNA-seq,比對基因組後,分別得到72,309和71,776個基因,表達量顯示1066個unigenes在組間差異表達(FDR ≤ 0.05,|log2FC|≥1)。

其中C3的45.34?46.45 Mb區域內總共鑒定到114個unigenes,2個基因(BnaC03g56870D和BnaC03g56670D)呈現組間差異表達(圖3C)。

5

qPCR驗證候選基因

對兩個差異基因BnaC03g56870D,BnaC03g56670D以及一個隨機DEG, BnaC03g57010D進行qPCR實驗,結果表明三個基因的表達模式與RNA-seq基本一致。

BnaC03g56670D組間差異較小,NCBI, TAIR和Genoscope databases注釋該基因是一個RNA helicase,因此和不育性沒有太多關聯;BnaC03g56870D在花蕾中顯著差異表達,資料庫注釋該基因與擬南芥中的CYP86C4基因相似,是一個重要的雄性可育相關基因。

圖4. 不育和可育樣本中不同組織候選基因驗證。

總 結

本文是DNA和RNA兩組學整合,篩選候選基因的案例,思路清晰,兩組學結合縮小了候選基因的篩選範圍,高效的鎖定了目標基因;良好的樣本是成功的一半,作者通過多年的積累得到甘藍型油菜的近等基因系,為後續工作打好基礎。

今天的內容就到這裡啦~

喜歡這篇文章嗎?立刻分享出去讓更多人知道吧!

本站內容充實豐富,博大精深,小編精選每日熱門資訊,隨時更新,點擊「搶先收到最新資訊」瀏覽吧!


請您繼續閱讀更多來自 基迪奧生物 的精彩文章:

多組學數據解析沙龍嘉賓報告公布!

TAG:基迪奧生物 |