Nature的文獻精讀—反其道而行之開發抗癌藥物研究

總結

本周為大家詳細解析2017年10月26日發表在Nature上的一篇文章，這篇文章思路很有意思，另闢蹊徑，通過抑制p53去泛素化酶USP7從而穩定p53結構從而達到抑癌效果，p53—「undruggable target」一直很難成為藥物靶標由於相互作用蛋白網路複雜等原因。我們知道，泛素化控制細胞內許多蛋白的穩定性，其功能失調造成許多疾病包括癌症的生成。去泛素化酶去除蛋白的泛素化，抑制它可使得蛋白降解。利用這一思路，來自英國MRC分子生物學實驗室通過高通量篩選找到去泛素化酶USP7特異性抑製劑通過抑制MDM2的E3泛素連接酶重新激活p53抑癌基因，並且在結構生物學共晶結果和細胞動物水平上得到抗癌驗證。

背景

轉錄因子p53是關鍵抑制因子，在50%人類癌症中缺失突變，主要機制是其被蛋白酶降解，穩定重新激活p53是治療癌症新策略。MDM2的E3泛素連接酶被去泛素化酶保護防止降解，其可以結合p53使其不穩定，進而降解，之前有文獻報道Nutlins可以組織MDM2–p53 連接以及p53缺失, 在臨床前研究取得好的結果。目前報道的USP7的小分子抑製劑活性較低(微摩爾級別)，並且靶標特異性還不清楚 。研究人員特異性靶向抑制USP7，增加p53水平，從而抑制腫瘤生成。

結果

1

特異性USP7 抑製劑的發現

研究人員通過泛素—羅丹明體系篩選專利報道的50萬不同具有吡咯和吡唑並嘧啶結果的小分子抑製劑。通過SPR技術證實直接結合USP7的先導化合物，通過結構優化合成共價抑製劑FT827和非共價抑製劑FT671 (Fig. 1a)，FT671親和常數僅有65nM, IC50是52nM。並且，FT671和FT827在38個去泛素酶家族（DUBs）中特異性抑制USP7。

在乳腺癌細胞MCF7中，FT827和FT671共同在孵育HA–UbC2Br標籤，發現隨著抑製劑濃度梯度增大抑制USP7表達。IP檢測36個DUBs只有USP7表達抑制，綜上證實FT827和FT671是特異性的USP7抑製劑。

2

USP7-抑製劑結合複合物結果解析

USP7分別與FT671和FT827共晶結構已解析，分別率分別是2.35和2.33 ?。USP7催化結構域像手一樣，化合物結合在拇指與手掌指導C端進入活性位點。非共價FT671延伸至手指區與Cys223產生相互作用。共價的FT827不延伸向手指區域但是伸長至催化口袋與Cys223共價結合。可以觀察到Cys223在抑製劑結合後發生構象變化，進一步形成泛素結合通道特別是殘基Phe409的旋轉，打開疏水口袋。這說明USP功能域結合抑製劑後可塑性，證實FT671和FT827結合USP7具有高親和力，結合位點分析解釋了結合複合物的競爭機制。

3

小分子結合特異性的分子基礎與結合特性

獨特的USP7拇指結構域具有變化loop變構調節機制，這個loop位於α4和α5螺旋，使得小分子具有足夠空間結合USP7，並且這個loop在小分子結合後構象改變阻止Tyr465拇指連接，與小分子形成氫鍵，也為小分子留出結合空間。Tyr465和Tyr514形成結合通道是的產生獨特的loop改變使得抑製劑可以特異性結合USP7靶標。

通過上述結合位點分析通過結合位點殘基突變驗證化合物結合特異性。Q297A去除氫鍵作用保留結合和些許催化活性，但是小分子抑制作用消失。在變化loop重要突變F291N大大降低化合物結合，變化loop通過C端和激活蛋白GMPS對USP7進行內源性變構調節，這些證據說明化合物可以特異性結合USP7。

4

FT671抑癌生物功能學活性

在人結腸癌HCT116和骨肉瘤細胞U2OS中，FT671可以增加P53表達，以及其下游靶基因包括BBC3，P21，RPS27L增加和MDM2降解，與敲減USP7效應一致。在HCT116中穩轉WT USP7和USP7突變通過Flp-In TRex系統，在FT671處理後只有再轉入突變USP (Q297A／F291N)不能增加P53表達。

5

FT671體內抑癌生理特性

通過CellTiter-Glo實驗證實FT671可以抑制MM.1S骨髓瘤細胞增殖，IC50僅有33 nM。在體內，異種移植MM.1S細胞在非肥胖型糖尿病–嚴重聯合免疫缺陷小鼠模型，隨機分組實驗。每天口腔灌胃給予FT671於25 mg kg?1, 75 mg kg?1 or 200 mg kg?1，葯代動力學檢測不同時間點p53水平，發現p53在給葯短時間內穩定存在，24h後p53水平回復到與對照組相同。每日灌胃FT671劑量100 mg kg?1 and 200 mg kg?1，明顯可以隨濃度梯度抑制腫瘤生長。高濃度FT671有很好耐受性，沒有出現明顯體重減輕等不良反應。

原文地址：http://www.nature.com/articles/nature24451

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