今日Cell：丁勝教授組運用CRISPR成功構建誘導性多能幹細胞
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今天，Cell子刊《Cell Stem Cell》在線發表了清華大學藥學院丁勝教授研究組的一項研究。研究表明，通過使用CRISPR-Cas9系統靶向激活內源Oct4或Sox2基因，可以成功實現體細胞多能性的誘導。該研究不僅提供了一種構建誘導性多能幹細胞的方法，也幫助人們更好地理解了表觀遺傳修飾調控細胞命運的機制。
導性多能幹細胞
2006年，通過向細胞中導入4種轉錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)，日本科學家山中伸彌在體外誘導成熟分化的體細胞，將其重編程為具有多向分化潛能的幹細胞（圖1）。這類細胞被稱為誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。山中伸彌因此項工作獲得了2012年的諾貝爾生理醫學獎。
iPSC在再生醫學領域有重要應用價值。將患者特異的iPSC誘導分化後，可用於細胞治療，實現個體化醫療，解決異體移植的免疫排斥問題，同時避開了使用人胚胎幹細胞所涉及的倫理障礙。
目前，已先後製備出帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征、1型糖尿病、肌萎縮側索硬化症等疾病的特異性iPSC。2013-2014年間，日本完成首例臨床試驗，通過將患者的多能幹細胞生成視網膜色素上皮細胞，治癒了年齡相關性黃斑變性，使其重獲光明。
圖1 iPSC的製備及應用
多年來，為了簡化重編程誘導步驟，提高誘導效率，提升應用安全性，研究人員不斷嘗試優化誘導細胞重編程的方法。丁勝教授也一直在該領域探索，提出了實現體細胞重編程的多種方法。
那麼，怎麼才能知道體細胞出現多能性呢？ 2012年，一項單細胞水平的研究工作明確了重編程各個階段的標誌基因。通過檢測Sox2等多能性相關基因的表達，可以判斷細胞是否獲得了多能性。將這些誘導獲得的多分化潛能的細胞注入小鼠囊胚，如果能夠正常分化發育產生小鼠後代，說明所用的iPSC構建成功。
CRISPR-Cas9系統在調控基因表達中的應用
廣為人知的CRISPR-Cas9系統常被用於編輯基因，消除特定基因的表達。除此之外，通過對該系統進行改造，還可將其用於激活或抑制基因表達。
具體來說，將CRISPR-Cas9系統中Cas9蛋白的兩個具有核酸內切酶活性的結構域HNH和RuvC分別進行H840A和D10A定點突變，從而得到失去核酸內切酶活性的dCas9(deadCas9)蛋白。dCas9無法切割DNA，但dCas9通過與相應的sgRNA結合可以激活或抑制靶基因的表達（圖2）。
圖2 dCas9可以連接效應子（轉錄激活子或抑制子）形成融合蛋白，用於靶向基因調控。（來源：abmgood.com，改編自Gilbert等人2013年的圖）。
染色體作為遺傳物質，是由DNA纏繞在組蛋白上組裝而成。組蛋白上發生的甲基化、乙醯化、泛素化，以及DNA上發生的甲基化修飾等都影響著基因轉錄。這部分內容屬於表觀遺傳學（epigenetics）的研究範疇，即在不影響基因DNA序列的情況下調控基因活性的機制（圖3）。
圖3 調控基因表達的表觀遺傳機理
細胞的重編程實則是一個表觀遺傳修飾重塑的過程。特定的表觀修飾能使染色質結構由緻密變鬆散，轉錄調控蛋白更容易接近基因的啟動子或增強子區，進而啟動基因表達（圖4），改變細胞特徵。因此，組蛋白修飾與細胞能否啟動重編程、獲得多向分化潛能密切相關。
圖4 緻密染色質中的基因增強子和啟動子關閉，阻礙基因表達和細胞重編程（上圖）；鬆散染色質中基因增強子和啟動子開放，允許轉錄因子結合，有助細胞重編程（下圖）。
（來源：EMBO期刊）
那麼，改變特定基因位點的表觀遺傳特徵，是否就能夠觸發細胞重編程，或者操縱細胞命運呢？
為了回答這個問題，近期，清華大學丁勝教授組在這方面做出了新的嘗試。其中，能靶向特定位點的CRISPR-Cas9系統發揮了重要作用。
通過改變內源基因的表觀特徵來誘導多能性
與傳統的iPSC構建方法不同，丁勝教授課題組並沒有向細胞轉入外源的多能性相關基因，而是通過重塑內源多能性基因的表觀遺傳特徵，啟動基因表達，進而誘導小鼠胚胎成纖維細胞重編程為iPSC。
在這項研究中，丁勝教授課題組使用了dCas9-Sun-Tag-VP64系統（圖5）。該系統中的多個VP64轉錄因子可接近靶基因位點，通過募集多種表觀遺傳修飾因子，增強染色質重塑活性，啟動並增強基因轉錄。
圖5 丁勝教授課題組使用的激活基因表達的dCas9-SunTag-VP64系統(下圖)（來源：Cell，2014）
為了監測細胞多能性的誘導過程，他們使用了表達Oct4-EGFP報告分子的細胞——多能性標誌基因Oct4被活躍轉錄的同時，細胞中會檢測到強烈的EGFP綠色信號。
在這項研究的開始，他們將含有數個sgRNA（共18個）的CRISPR靶向庫導入細胞，使其作用於數個多能性相關基因的啟動子區。他們發現，這些基因的轉錄表達能夠使體細胞重編程，形成可以穩定傳代的iPSC（CRISPR iPSC）（圖6）。
圖6 通過靶向內源基因，成功構建能穩定傳代的iPS細胞系
為了鑒定出啟動重編程的關鍵基因，他們通過一一刪減靶向庫中的靶向基因，發現如果不靶向Oct4、Sox2或Glis1基因，具有多能性的細胞群落會大大減少，表明這些基因對多能性的誘導至關重要。同時，他們注意到細胞重編程的效率明顯依賴於Sox2基因的表達水平，事實上，單獨針對Sox2啟動子的改造即能誘導細胞產生多能性。
但是，以上方法獲得的iPSC的比例並不高，他們猜測這或許與所使用的小鼠體細胞的遺傳背景和轉導效率有關。基於這一點，丁勝教授組用之前獲得的CRISPR iPSC，構建了二代小鼠胚胎成纖維細胞S-17。他們發現使用S-17細胞進行誘導，可以大大提高重編程效率。
其中，dCas9-Sun-Tag-VP64系統可通過改變Sox2和Oct4基因啟動子區的組蛋白乙醯化水平，來啟動二者的表達。他們還證明，靶向Sox2單基因座能啟動其轉錄表達，繼而誘導其他多能基因表達，建立多能性網路。
在這個研究過程中，丁勝教授研究組注意到Oct4啟動子和增強子的表觀重塑對於多能性誘導非常重要。但是僅靶向Oct4的啟動子不足以產生EGFP陽性細胞集落。在高表達Oct4的小鼠胚胎幹細胞中，Oct4基因的遠端增強子處富集著p300、介體複合物和關鍵多能性因子。因此，他們推測細胞多能性的誘導可能需要同時重塑Oct4的啟動子和增強子。
為了驗證這一點，他們使用了轉錄靶向兩個不同位點的雙sgRNA，在單細胞水平上同時靶向Oct4啟動子和增強子區，提高了組蛋白乙醯化水平，並最終實現了重編程的誘導。在獲得了具有多能性的細胞之後，他們將其注射入小鼠囊胚，成功實現了種系傳代。
這些數據表明，通過同時重塑內源性Oct4的啟動子和增強子區的表觀特徵，能夠有效地誘導出細胞多能性。
然而，在這個靶向系統中，VP64的染色質重塑功能主要是因為它能夠招募轉錄因子和表觀修飾因子，而非直接改變表觀修飾。那麼，直接重塑表觀特徵是否足以啟動重編程呢？
為了明確這一點，丁勝教授組採用了另一個靶向系統——dCas9-SunTag-p300core，該系統能夠特異性地增加Oct4啟動子和增強子區的組蛋白乙醯化水平。
p300是一類乙醯基轉移酶，通過與CRISPR-Cas9系統聯合，成為了一個非常強大的操縱基因表達的工具。p300 core是p300的活性結構域，它取代了之前系統中VP64的位置，可以增強靶標的組蛋白乙醯化水平（圖7）。
圖7 dCas9與p300的核心催化結構域融合，可以使靶位點乙醯化，發生表觀構象重塑。該作用與轉錄因子、RNA聚合酶II協同上調靶基因轉錄。（來源：abmgood.com，改編自Zentner等人2015年的圖）。
丁勝教授組發現，p300 core的組蛋白乙醯化靶向功能類似於VP64的染色質重塑功能，都能夠重塑Oct4啟動子和增強子的表觀特徵，並足以觸發重編程，使細胞獲得多能性。這項結果有力地證明了單獨改變基因的表觀特徵即能實現重編程。同時也證明了組蛋白乙醯化在iPSC誘導過程中的關鍵作用。
小結
多能性幹細胞的誘導通常需要引入轉錄因子來激活多能性網路。但是人們並不清楚到底是哪些內源性染色質的重塑事件觸發了重編程。
在這項研究中，丁勝教授組採用CRISPR激活系統靶向內源基因Oct4和Sox2（圖8），精確重塑這兩個基因位點的表觀特徵，最終成功構建了iPSC，幫助人們更好地理解了定向染色質重塑觸發重編程的機制。
圖8 利用CRISPR-Cas9系統構建iPSC (來源：Liu et al., 2017, Cell Stem Cell)
這項研究中使用的重編程技術也應該適用於其他的細胞類型以及模型。在人類細胞中的應用情況有待進一步研究確認。
論文中還提到，除了p300之外，已被證實還有其他幾個表觀遺傳修飾因子（Tet1、Dnmt3a、KRAB和LSD1）也具有編輯表觀基因組的功能，可以用於激活或沉默基因。聯合CRISPR系統的靶向功能，這些工具均可以應用於對不同類型的DNA和組蛋白修飾進行定向編輯，進而操縱細胞命運。
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4Tanenbaum ME, et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014 23;159(3):635-46
5Liu et al., CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogrammingto Pluripotency, Cell Stem Cell 2017, https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.12.001
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